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- 【导读】目的要求1、熟悉细胞周期的基本概念、原理,掌握实验操作的流程和方法。2、观察流式细胞仪检测、分析细胞周期的各种峰形图的意义。3、了解细胞周期测定实验的用途。二、原理细胞周期是指从一...
目的要求
1、熟悉细胞周期的基本概念、原理,掌握实验操作的流程和方法。
2、观察流式细胞仪检测、分析细胞周期的各种峰形图的意义。
3、了解细胞周期测定实验的用途。
二、原理
细胞周期是指从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束所经历的时间。细胞周期反映了细胞的增殖速度,周期越短说明细胞的增殖速度越快。测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法和流式细胞仪测定法等。流式细胞仪测定法是利用溴化乙锭(PI)渗入测定细胞周期的方法。溴化乙锭加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含溴化乙锭的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。
三、材料
1、秋水仙素。
2、溴化乙锭(1.0mg/ml)。
3、无水乙醇。
4、RPMI1640完全培养基。
5、RNaseA(1mg/mL)。
6、PBS。
7、6孔细胞培养板。
8、离心机。
9、流式细胞仪。
10、细胞培养箱。
四、方法
1、取1×106对数生长期的细胞接种于6孔板,调整好细胞生长状态。
2、离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗涤两次。
3、加入预冷70%乙醇0.5ml,于4℃固定30分钟。
4、离心收集细胞,取1mLPBS洗涤一次,加入0.2ml反应液(含50μg/mL溴化乙锭,100μg/mLRNaseA和0.2%TritonX-100的PBS),4℃避光孵育30分钟。
5、PBS洗涤两次,用流式细胞仪检测分析。
五、注意事项
1、实验操作过程中动作要尽量轻柔,不可用力打碎细胞。
2、RNA酶Z好现加,以彻底去除细胞中RNA的干扰。
3、溴化乙锭是光敏物质,操作过程中注意避光。
4、Z后一步的洗涤应尽量弃净上清,以免游离PI残留影响实验结果。
六、思考题
1、认真查阅资料,测定细胞周期的方法还有那些?
2、如何使培养板中用于测定的细胞周期同步化?
3、细胞周期测定可应用于哪些方面的研究?
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