圆二色光谱仪简介

圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。

圆二色性

圆二色性是研究分子立体结构和构象的有利手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。圆二色值的正负改变称为Cotton效应。常造成Cotton效应的结构因素大致有3种：

(1)有固定的手性发色团产生的，如不共面的取代联苯化合物；

(2)原发色团是对称的，但处于手性环境中而被歪曲，如环已酮中邻位有取代时；

(3)有分子轨道不相互交叠的发色团偶极相互作用产生的。

某一化合物有无圆二色性，要看其是否具备以上三点中的任意一点。圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM=εL–εR，其中，εL和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL–εR>0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL–εR<0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和ΔεM之间的关系式：[θ]=3300*Δε圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：[θ]=100θ/cl，ΔεM=θ/33cl其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。

圆二色光谱

圆二色光谱是一种差光谱，是样品在左旋偏振光照射下的吸收光谱与其在右旋吸收光谱照射下的偏振光之差。物质的吸收光谱决定物质的颜色。如果一个物质对左旋偏振光和对右旋偏振光的吸收不同，那么称该物质具有圆二色性(简称CD)。同样，如果一个物质对于不同方向的线偏振光的吸收不同，那么该物质具有线二色性。很多各向异性的晶体具有线二色性；而很多生物大分子和有机分子具有圆二色性。历史上，圆二色性又称为光学活性，巴斯德在19世纪就发现并研究了柠檬酸的光学活性。圆二色光谱是研究手性分子结构的重要工具。因为左旋光和右旋光互为镜面对称，所以镜面对称的结构对于左、右旋光的吸收不表现差异性。只有镜面不对称的结构，即手性结构才有可能对左、右旋光的吸收表现出差异性。由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构，圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，因此圆二色光谱技术成为生物物理和生物化学研究中的一个非常重要的手段。除了生物大分子之外，还有很多有机分子，特别是药物分子，也有手性的结构，圆二色光谱技术也是研究这些分子结构的重要工具。

圆二色光谱仪

圆二色光谱仪是一个差吸收光谱仪。圆二色光谱仪的设计和制作则远比吸收光谱仪的设计和制作复杂。首先，圆二色光谱仪的光谱范围宽。很多生物大分子，如蛋白质是无色的。也就是说，这些蛋白质在可见光波段没有吸收，在可见光波段也没有圆二色性。蛋白质分子的手性结构所引起的圆二色性主要在远紫外波段，最小波长到190nm，因此圆二色光谱仪的光谱范围也要能够覆盖这个波段。同样，有些色素分子的圆二色性在近红外波段，因此圆二色光谱仪的波长范围要覆盖190~900nm。为满足这个指标，圆二色光谱仪的光源、光学器件和探测器的技术要求都要比吸收光谱仪高。其次，圆二色光谱仪需要设计专门的起偏器件，这个起偏器件要能够生成左旋圆偏振光和右旋圆偏振光。第三，由于圆二色光谱是差吸收光谱，其信号要比吸收光谱弱很多，这对仪器的检测器和放大器都提出很高的要求。吸收光谱仪一般用光电管作检测器，而在圆二色光谱仪中均用光电倍增管。由于光谱范围的要求，在近红外段，还需要更换对红外光敏感的光电倍增管。在放大器部分，需要采用一定的调制技术来提高信噪比。

圆二色光谱仪

圆二色光谱仪结构

仪器主要由光源、单色仪、起偏器、调制器、光探测器等单元组成。光源采用氙灯。调制器则受一个50kHz的电压信号控制，其光学介质的光学特性也以相同频率变化，输出50kHz交替变化的左、右旋单色圆偏振光。调制器输出的光作为入射光照射在样品上，如果样品在此波长下有圆二色性，那么透射光的光强也随着左、右旋圆偏振光的交替变化而变化。光电倍增管把光强转换为电流，也将变化的光强信号转换为交流信号。这个交流信号的强度就反应了样品在这个波长下的圆二色性的数值大小，用H表示，圆二色数值的单位是椭圆度。改变波长K，测量不同波长处样品的H，就得到样品的圆二色光谱。

圆二色光谱仪结构简图

圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。根据Lambert-Beer定律可证明椭圆率近似地为：θ=0.576lc(εl-εd)=0.576lcΔε公式中l为介质厚度，c为光活性物质的浓度，εl及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。测量不同波长下的θ(或Δε)值与波长λ之间的关系曲线，即圆二色光谱曲线。在此光谱曲线中，如果所测定的物质没有特征吸收，则其Δε值很小，即得不到特征的圆二色光谱。当εl>εd时，得到的是一个正的圆二色光谱曲线，即被测物质为右旋；如果εl<εd，则得到一个负的圆二色光谱曲线，即被测物质为左旋。

圆二色光谱仪特点

与其他仪器相比圆二色光谱仪有着独特的优点。首先，圆二色光谱仪仅对特定结构的物质有反应，因此对于组成复杂的体系，圆二色光谱仪比紫外分光光度计选择性高，干扰少，可用于药物和食品添加剂中的光学活性物质的测定。其次，在目前的热门研究领域蛋白质组学中，圆二色光谱仪也占有一席之地。X射线晶体衍射法是目前确定蛋白质构象最准确的方法，但对蛋白等生物大分子物质，其结构复杂且为柔性，得到所需的晶体结构较为困难，相比之下，圆二色光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、相对准确的方法，样品较易获得。另外，圆二色光谱对溶液中蛋白质、核酸等大分子的立体结构变化高度灵敏，能检测到立体化学的微小变化。可见，圆二色光谱仪在医药领域有着广泛的应用前景。

蛋白质的圆二色性

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，同时也是具有多个手性中心的分子。蛋白质一般有一级结构、二级结构、三级结构和四级结构几个结构层次。在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。 蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范围，即178—250nm的远紫外区和250-320nm的近紫外区。远紫外区的CD光谱反映了肽键的圆二色性，主要是由C-N键的n→P和C-O键的P→P跃迁引起的。而近紫外圆二色作为一种灵敏的光谱探针，可反映蛋白质中芳香氨基酸残基、二硫键微环境的变化，但该区要求样品的浓度大，约高出远紫外区样品浓度1-2个数量级。在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此，具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息。

药物与蛋白结合后必然导致蛋白的空间结构发生改变，这种改变可能是微小的，也可能是巨大的。圆二色光谱仪的检测灵敏度远高于紫外，因此，不论是微小的变化还是巨大的变化，其都能检测出来。结构变化的直观表现就是圆二色光谱图，若结构变化较大，则谱图上所表现出的Cotton效应将变化明显，可以直接对比反应前后图谱的差异来判断反应是否进行；若药物结合后对蛋白的结构影响较小，比较图谱无法得出明显的差异，可以利用软件计算A-螺旋、B折叠、转角及不规则卷曲的百分含量，比较数值得出结论。