以无菌操作取25 g样品，放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000 r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替).
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10**-2、10**-3、10**-4…….从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min.
附：这是一种9管MPN法测定方法.
LST和EC初步筛选：
对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液.每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种1mL.将接种管置于36±1℃培养48±2h.
观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中.将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养48±2h.
EMB平板：
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h.
检查平板上有无具黑色ZX有光泽或无光泽的典型菌落.
如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落.用接种针接触菌落ZX部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h.
平板划线示例
EMB平板原理及照片
生化试验：
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验.
1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应.
2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h.以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性.
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液.如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应.
3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长.
4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气.
5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色.大肠杆菌为革兰氏阴性.
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
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靛 基 质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型
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－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌
＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌
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如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做
重复试验.
结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值.
