M基因是传染性支气管炎病毒重要的免疫原基因之一,M基因上可能存在重要的抗原决定簇,且在进化过程中具有高度保守性。本研究在对IBV结构蛋白基因分析研究的基础上,选取IBV的M基因,通过PCR扩增在两端引入BamHⅠ酶切位点,经酶切插入“自杀性”DNA疫苗载体pSC... M基因是传染性支气管炎病毒重要的免疫原基因之一,M基因上可能存在重要的抗原决定簇,且在进化过程中具有高度保守性。本研究在对IBV结构蛋白基因分析研究的基础上,选取IBV的M基因,通过PCR扩增在两端引入BamHⅠ酶切位点,经酶切插入“自杀性”DNA疫苗载体pSCA1 CMV IE启动子之下的克隆位点,构建了“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCA1-M。经由菌落PCR、酶切及测序鉴定目的基因被成功克隆至载体pSCA1,且方向正确。分别取等量的重组质粒pSCA1-M、常规IBV M基因DNA疫苗pcDNAM及空载体pSCA1转染Vero细胞。48h后经间接免疫荧光试验观察发现,pSCA1-M以及pcDNAM转染组细胞浆均可见特异性亮绿色荧光,pSCA1空载体组无荧光为阴性。这证实“自杀性”DNA疫苗载体能成功表达M基因。而pSCA1-M组所发荧光细胞数比pcDNAM组少,说明的“自杀性”DNA疫苗转染率低于常规DNA疫苗。
为评价IBV “自杀性”DNA疫苗的免疫效果,分别用构建的“自杀性”DNA疫苗pSCA1-M、常规DNA疫苗pcDNAM、空载体pSCA1和IBV灭活疫苗免疫非免疫健康雏鸡,并设对照组注射等量的PBS液。自免疫后每隔一周各组鸡只采血分离血清连续五周,采用流式细胞仪(FACS)和间接ELISA试验分别对宿主外周血T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+和特异性抗IBV血清IgG的动态变化进行检测,并在第五周后以IBV强毒株进行攻毒保护实验。间接ELISA试验检测结果表明,我们构建的“自杀性”DNA疫苗能刺激机体产生针对IBV的特异性血清抗体,免疫后第三周上升到峰值,随后开始下降,其抗体水平与常规IBV DNA疫苗相当,低于灭活疫苗。T淋巴细胞亚类动态变化结果显示,“自杀性”DNA疫苗pSCA1-M组CD3+、CD4+、CD8+各T淋巴细胞数量均高于其余各组,表现为差异显著(P<0.01或P<0.05)。但在第4周左右有一个明显的下降,之后又略有回升。这说明“自杀性”DNA疫苗能诱导机体产生高于常规DNA疫苗和灭活疫苗的细胞免疫,但随着宿主细胞的凋亡迅速下降。攻毒保护试验结果统计,pSCA1-M组鸡只发病率为12%,保护率为50%;pcDNAM组鸡只发病率为13%,保护率略低于pSCA1-M,为40%;空载体组发病率(75%)<对照组(85%),攻毒保护率两组相同为25%;灭活苗组无鸡只发病死亡。对强毒的抵抗力单基因的“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗相当(40%)<灭活苗()。
本研究采用IBV M基因构建“自杀性”DNA疫苗对鸡进行免疫,并对其免疫效果进行评价,在国内外还未见报道。可为研制IBV “自杀性”DNA疫苗提供了基础材料和科学依据。
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