蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南二

选择合适的色谱柱
 
微粒。通过与柱内填充微粒疏水表面的相互作用实现蛋白质与多肽的分离。
柱内填充粒通常以硅胶为基础，这是因为硅胶的稳定性高，能够在大多数溶剂条件下（除了pH大于6.5的情况）保持稳定，此外，硅胶可以形成各种大小的具有不同直径的多孔球形颗粒。

硅胶纯度。GX液相色谱柱所用硅胶填料的纯度对分离性能至关重要。金属离子杂质会导致峰拖尾和分辨率下降，如图7A所示（0.01%和0.005%的TFA）。
含金属离子杂质（图7A）的硅胶需要采用高浓度离子对试剂（如三氟乙酸（TFA））维持良好的峰形。

图7. 硅胶纯度会影响多肽的峰形，尤其是加入的离子对试剂浓度较低时。高纯度硅胶所需离子对试剂的浓度远比低纯度硅胶低。

洗脱液：加入如图所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为37.5分钟。

低浓度TFA会导致峰形较差且分辨率下降。硅胶纯度较高时（图7B），0.005%的低浓度TFA会产生良好的峰形。这在液相色谱-质谱联用法中尤其重要，因为在使用电喷雾接口时TFA会导致信号减弱。液相色谱-质谱联用法中低浓度的TFA会获得更好的检测信号。

孔径。通常，反相GX液相色谱法中小孔（~100埃）硅胶分离蛋白质的效果较差。大孔硅胶（~300埃直径）可以更好地分离蛋白质（参考文献4）。
如图8所示，蛋白质无法进入小孔，只与极小的外表面相互作用实现分离。
大孔硅胶允许蛋白质，甚至更大的多肽进入小孔，从而与疏水界面充分作用，因此Z终的峰形更好，分辨率更高。如今，大孔硅胶已普遍应用于蛋白质的分离中。
由蛋白酶水解等产生的小分子肽能够进入小孔硅胶的孔隙内，从而与疏水界面相互作用，因此小孔硅胶也可用于蛋白质水解物的分离。
但是大孔硅胶也能较好地分离多肽，且具有不同的选择性和分辨率。

图8. 反相GX液相色谱（左侧）常用的小孔（~100埃）粒子只允许少量蛋白质进入孔内，因此限制了表面相互作用。大孔粒子（~300埃，右侧）允许蛋白质进入孔内与疏水界面相互作用。

疏水界面。用碳氢化合物分子对硅胶进行改性，从而形成疏水界面。
含烃链的氯硅烷，如十八烷基氯硅烷，与硅胶（表面有极性硅烷醇基）反应使碳氢化合物附着在硅胶表面（图9）。
由于位阻效应，有机硅烷分子仅与硅胶表面部分硅烷醇基反应，因此大量的极性硅烷醇基仍然会留在硅胶表面。
在“封端”过程中，较小的有机硅烷依次与极性硅烷醇基反应，从而减少硅胶表面极性硅烷醇基的数量。

选择分离表面。硅胶表面改性所用的化学过程允许多种有机基团附着在硅胶表面。
Z常见的改性是键合一条十八碳线性脂肪链，形成“C18”柱或ODS柱（图10A）。
如图所示，有机氯硅烷与大多数硅烷醇基反应，但仍有部分不反应，这会在硅胶表面形成一层较厚的碳氢化合物层。
蛋白质和多肽可以吸附到该碳氢化合物层。
C18柱尤用于分子量小于2~3000道尔顿多肽的分离，并且通常是分离由蛋白酶水解蛋白（见26~31页）产生的多肽以及分离天然和合成肽的选择柱。
由丁基键合至硅胶表面形成的疏水相较少（图10B）。
丁基相Z适合蛋白质分离，但也可用于分离大分子肽或疏水性肽。

图9. 通过利用有机氯硅烷将疏水性配体化学键合到硅胶表面形成了疏水界面。

蛋白质可用C18柱分离，但一些蛋白质利用C18柱分离峰形较差或出现拖尾峰，因此蛋白质分离推荐用C4柱。
其它用于多肽分离的柱包括苯基柱（参考文献6），其在疏水性方面与C4柱类似，是一种极性嵌入或极性封端柱，能够增强多肽与硅胶粒子表面的相互作用。
因此，对多肽具有不同的选择性。

多肽选择性。柱对多肽的选择性受键合相性质和特征以及底层硅胶表面的影响。不同的反相柱具有不同的多肽选择性。尤其是：

• 硅胶表面的相数（碳负载）影响选择性。当键合到硅胶表面的碳氢化合物较少时（较低的碳负载），相比于碳负载更高的柱，极性硅烷醇基对分离的影响更大，因此会导致选择性不同。

• 不同的制造工艺会产生性质不同的硅胶，从而影响多肽的选择性。
  

图10.

A    C18疏水柱用于分子量小于2000-3000道尔顿多肽的分离效果
B      C4疏水柱用于分子量大于3000道尔顿的多肽以及蛋白质的分离效果。

柱长度。小分子与硅胶粒子表面相互作用越多,分辨率就越高；采用长柱比短柱的分辨率高。

但吸附在柱顶附近的蛋白质随后会被洗脱下来,被洗脱后与硅胶粒子表面的相互作用就不再明显（图11）。

尽管数据显示蛋白质与硅胶粒子表面仍存在部分相互作用，但这种相互作用不具选择性，不能提高蛋白质间的分辨率。

柱的长度对蛋白质的分离没有影响，短柱和长柱的分离效果相同。

由于与蛋白质相比，多肽与疏水性反相粒子表面的相互作用较弱，因此柱的长度在多肽和蛋白质水解物的分离中的影响更大。

如图12所示，采用长柱分离多肽的分辨率通常比短柱要高。

多肽分离建议采用长度为15或25厘米的色谱柱。

图11. 蛋白质在柱顶附近吸附和解吸。解吸后，蛋白质几乎不与疏水相发生相互作用，因此增加柱的长度不会提高与蛋白质的分辨率，而会提高与小分子的分辨率。

图12. 与蛋白质相反，多肽通常在长柱上分辨率更高。

色谱柱：C18小孔，4.6 x 150或250 mm
洗脱液：梯度：0 - 70% 乙腈，60分钟洗脱

柱内径。分析型HPLC柱的标准内径为4.6 mm。此类柱的Z佳流速为~1 ml/min。

市场上可买到孔径更小的柱，多用于满足特定要求和目的。

细孔柱（~2 mm内径）的流速为~ 200微升/分钟，因此与4.6mm内径的分析柱相比，所用溶剂更少。

同时，细孔柱的灵敏度约为标准分析柱的五倍。

这是因为每分钟流过检测器的溶剂量更少，导致蛋白质或多肽的峰值浓度更高。

紫外检测器和电喷射质谱仪等浓度型检测器对小孔柱的灵敏度更高。

微径柱的流速为~50微升/分钟，因此采用微径柱的灵敏度更高，约为分析柱的50倍。

毛细管柱的流速为1~50微升/分钟，具有更高的相对灵敏度，约为分析柱灵敏度的200倍。

但由于所采用的流速和更大的死体积，微径柱和毛细管柱需要特殊仪器。

在使用微径柱的过程中必须格外小心。

图13和附录中总结了柱的特性。

图13. 不同内径色谱柱的特性