DNA分子杂交的southern blotting的过程是什么?
1、制备样品DNA
2、限制性内切酶消化样品DNA
3、凝胶电泳分离消化产物
4、如果靶序列>5kb,在0.25M的HCl中进行震荡脱嘌呤10min,ddH2O洗一次
5、用变性液震荡处理30min,ddH2O洗一次
6、中和液震荡处理30min
7、裁取合适大小的尼龙膜或硝酸纤维素膜进行转膜操作,可用真空转膜仪或者搭滤纸桥,需要20×SSC
8、制备探针,可用地 高 辛标记(以地 高 辛为例)
9、将膜放入杂交瓶,42°C预杂交30min
10、倒掉预杂交液,加入杂交液,适当的温度进行杂交4h至过夜
11、洗膜,先用2×SSC+0.1%SDS,20-25°C洗2×5min,再用0.5×SSC+0.1%SDS洗2×15min。然后用washing buffer洗1-5min,接着用blocking solution洗30min后,用antibody solution洗30min,再用washing buffer洗2×15min,再用detection buffer洗2-5min后,取出膜,放于保鲜膜上,在结合有DNA的一面滴加CSPD ready-to-use后,立刻盖上保鲜膜,让CSPD ready-to-use均匀的布满膜表面,室温放置5min后,37°C温育10min以上
12、放射自显影,可用成像系统信号累积模式显影或用X-ray显影
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