PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?
答:PCR圹增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数分子(或许是几十万个分子在这个点上应该还是正确的。
在测序时,错配现象也就是反映不出来了。因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板Z原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于pCR扩増时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减pCR扩增过程中的错配现象,在pR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶
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