大鼠肝细胞的分离

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实验试剂钠60mg/kg链蛋白酶E灌注液含Ⅳ型胶原酶的灌注液Histodenz液RPMI1640液胎牛血清碘酒乙醇实验设备高速离心机平皿硅化三角烧瓶“0”号丝线针管一次性输液管恒温振荡器120目、300目钢网50ml聚丙烯离心管实验材料实验室大鼠实验步骤1.大鼠以3％钠60mg/kg麻醉后，依次碘酒、乙醇消毒；2.以十字型切口打开腹腔，暴露内脏，将肠管推向腹腔的左侧，暴露出下腔静脉和门静脉，首先游离出下腔静脉，将胆总管结扎。然后分离门静脉，将其分支一一结扎，并在门静脉的近端和远端分别预置“0”号丝线一根，用针管内预先吸有肝素的l8号套管针穿刺门静脉，退出针芯，见门静脉有回血后结扎固定，迅速接通灌注系统，并剪开下腔静脉建立流出道，以20ml/min的速率灌注预灌注液（37℃），同时将肝脏完整地分离下来，置入一平皿中；3.灌注约10min后，肝脏完全变为淡黄褐色，关闭预灌注液三通开关，以15ml／min速率灌注50ml（25mg）链蛋白酶E灌注液，然后再以15ml／min速率灌注含Ⅳ型胶原酶的灌注液（37℃）；4.将一根一次性输液管一端浸入培养皿液面以下，另一端插入胶原酶溶液瓶，建立胶原酶的循环灌注；5.20～25min后，当肝脏组织完全变软，撕去肝包膜，去除结缔组织，钝性粉碎肝组织制备细胞悬液；6.将细胞悬液倒入一预先装有100ml、37℃预热的振荡消化液硅化三角烧瓶中，将三角烧瓶放恒温振荡器中振荡消化30min（200r／min，37℃），振荡消化后的细胞悬液依次经120目、300目钢网过滤，收集于2个50ml聚丙烯离心管中；7.1700r／min离心5min（4℃），吸弃上清液。每管加入40mlRPMI1640液，反复吹打，使细胞充分悬浮；8.200r/min离心2min（20℃）2次，使细胞悬液中剩余的肝细胞沉淀，去除肝细胞；9.上清液l700r／min离心5min（4℃），沉淀肝的非实质细胞，吸弃上清液，用RPMI1640液1700r／min离心5min（4℃）再冲洗2～3次；10.将33％的Histodenz液以RPMI1640液稀释成为11％Histodenz液，加入l1％Histodenz液重悬细胞沉淀，反复轻柔吹打，使细胞充分悬浮；11.配制15％的Histodenz液，在10ml离心管的底部先小心地铺4ml15％的Histodenz，然后将l1％Histodenz细胞悬液小心地铺在15％的Histodenz液上，上面再小心地滴加一层无血清的RPMI1640细胞培养液。在这一过程中一定要避免各层液体混合；12.两离心管3000r／min离心30min（4℃），垂直位小心取下离心管，可以看到明显的细胞分层，将11％Histodenz液与15％Histodenz液交界面间的细胞仔细地吸出，用无血清RPMI1640液1700r／min离心5min（4℃）冲洗2次；13.培养：用含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液将细胞悬浮，移人培养瓶，于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养30min，计数，以1×106个／ml的浓度接种于新瓶中培养，24h后洗去未贴壁的细胞，即可获得纯化的大鼠肝细胞。
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