动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒产品说明书
- 上传人： 上海科学仪器有限公司 |大小：221.87KB|浏览：363次|时间：2018-11-18
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- 文档简介
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动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒产品说明书主要用途动物细胞/组织活性线粒体分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的活性线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和培养细胞的活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品**。技术背景线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的Z常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：**，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。产品内容清理液（ReagentA）毫升裂解液（ReagentB）毫升净化液（ReagentC）毫升强化液（ReagentD）毫升保存液（ReagentE）毫升活性液（ReagentF）微升产品说明书1份保存方式保存净化液（ReagentC）和活性液（ReagentF）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备HANK平衡盐缓冲溶液（12028）或PBS缓冲溶液（12033）：用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗1.5毫升离心管：用于保存线粒体4℃台式离心机：用于沉淀细胞4℃超速离心机：用于分离细胞器成分DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞实验步骤一、动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（ReagentF）冻融，然后移出xx微升活性液（ReagentF）、xx毫升净化液（ReagentC）和4毫升的裂解液（ReagentB）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前**使动物空腹12至24小时）2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3．（选择步骤）加入适量的（1克组织需要xx毫升）清理液（ReagentA）清洗1次4．即刻用刀片切碎组织5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管6．加入预冷的xx毫升裂解工作液7．涡旋震荡5秒，充分混匀8．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项8）9．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管，10．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g11．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞12．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g13．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物14．（选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE）15．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g16．（选择步骤）小心抽去上清液17．加xx毫升保存液（ReagentE），充分混匀18．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（ReagentF）冻融，然后移出xx微升活性液（ReagentF）、xx毫升净化液（ReagentC）和xx毫升的裂解液（ReagentB）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前**使动物空腹12至24小时）2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3．（选择步骤）加入适量的（1克组织需要xx毫升）清理液（ReagentA）清洗1次4．移入一个液氮冻存管5．即刻放进液氮罐过夜6．次日从液氮罐里取出，即刻（Z快速度）碾碎组织（注意：切莫使组织冻融）7．放进一个15毫升锥形离心管8．加入预冷的xx毫升裂解工作液9．涡旋震荡5秒，充分混匀10．在冰槽里孵育2分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒11．加入预冷的xx微升强化液（ReagentD）12．涡旋震荡5秒，充分混匀13．在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒（注意：参见注意事项9）14．加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE），用手混匀15．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g16．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞17．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g18．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物19．（选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE）20．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g21．（选择步骤）小心抽去上清液22．加入xx毫升保存液（ReagentE），充分混匀23．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（ReagentF）冻融，然后移出xx微升活性液（ReagentF）、xx毫升净化液（ReagentC）和xx毫升的裂解液（ReagentB）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107），直至细胞生长铺满整个培养表面2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，3．小心抽去清洗液4．重复实验步骤2至3一次5．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面6．放进37℃培养箱孵育3分种7．手击震动培养瓶，使细胞脱落8．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液9．全部移入到一个50毫升锥形离心管10．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g11．小心抽去上清液12．加入xx毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞13．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g14．小心抽去上清液15．加入预冷的xx毫升裂解工作液16．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群17．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项8）18．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管19．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞21．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g22．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物23．（选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE）24．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g25．（选择步骤）小心抽去上清液26．加入xx毫升保存液（ReagentE），充分混匀27．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（ReagentF）冻融，然后移出xx微升活性液（ReagentF）、xx毫升净化液（ReagentC）和xx毫升的裂解液（ReagentB）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107），直至细胞生长铺满整个培养表面2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐溶液或PBS溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面28．小心抽去清洗液3．重复实验步骤2至3一次4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面5．放进37℃培养箱孵育3分种6．手击震动培养瓶，使细胞脱落7．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液8．全部移入到一个50毫升锥形离心管9．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g10．小心抽去上清液11．加入xx毫升预冷的清理液（ReagentA）12．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g13．小心抽去上清液14．加入预冷的xx毫升裂解工作液15．涡旋震荡5秒，充分混匀16．在冰槽里孵育2分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒17．加入预冷的xx微升强化液（ReagentD）18．涡旋震荡5秒，充分混匀19．在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒（注意：参见注意事项9）20．加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE），用手混匀21．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g22．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞23．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g24．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物25．（选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（ReagentE）26．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g27．（选择步骤）小心抽去上清液28．加入xx毫升保存液（ReagentE），充分混匀29．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里注意事项1．本产品为10次（1克动物组织或5X107细胞）或50次（200毫克动物组织或1X107细胞）操作2．实际操作的动物组织重量或细胞量与试剂使用量按比例调整：例如200毫克动物组织：试剂用量是标准用量的五分之一3．所有操作均须在4℃或以下状态进行4．操作时，须戴手套5．操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（ReagentB）和保存液（ReagentE）6．建议使用足够的样品量7．建议严格控制操作时间8．通常匀化次数为80下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数9．通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数10．对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理11．通常5X107细胞或1克动物组织的线粒体含量为50微克以上线粒体蛋白12．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解13．本产品所获得的线粒体纯度和产量Z为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少14．如果需要获得99％以上纯度的线粒体，使用动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒－10006.315．线粒体正常活性测定方法是：CITRATESYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等16．线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROMECOXIDASE活性和荧光JC染色17．本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等18．本公司提供系列线粒体分析试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整3．本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性4．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
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