细胞长链脂酰辅酶A合成酶活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书

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细胞长链脂酰辅酶A合成酶活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书主要用途细胞长链脂酰辅酶A合成酶（LONG-CHAINACYLCOASYNTHETASE；LACS）活性酶连续循环光度法定量检测试剂是一种旨在通过肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）长链脂酰辅酶A合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及Z后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段。脂酰辅酶A合成酶（acylcoAsynthetase；EC.6.2.1.3），又称为脂肪酸硫激酶（fattyacidthiokinase）或脂酰辅酶A连接酶（acylcoAligase），是脂肪酸进入β-氧化前的活化所必需：在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，催化饱和或不饱和直链脂肪酸分子（C4）连接辅酶A合成相应的脂酰辅酶A。其为一高能化合物，水溶性增强，提高代谢活性。当脂肪酸进入细胞后，在内质网及线粒体外膜上先被活化，形成脂酰辅酶A衍生物，然后再进入线粒体内氧化。脂酰辅酶A合成酶分成三种底物特异性的种类：小于4个碳（C4）的短链脂酰辅酶A合成酶（acetyl-CoAsynthetase），介于4至12个碳（C4－C12）的中链脂酰辅酶A合成酶（butyryl-CoAsynthetase），和大于12个碳（C12）的长链脂酰辅酶A合成酶（palmitoylCoAsynthetase）。基于长链脂肪酸棕榈酸（palmitate）和辅酶A在长链脂酰辅酶A合成酶的作用下，产生棕榈酰辅酶A（palmitoyl-CoA）后，通过肌激酶（myokinase）、丙酮酸激酶（pyruvatekinase）和乳酸脱氢酶（lacticdehydrogenase）系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reducednicotinamideadeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidizednicotinamideadeninedinucleotide；NAD）的变化（340nm波长），来定量分析长链脂酰辅酶A合成酶的活性。长链脂酰辅酶A合成酶连续循环反应系统为：Long-chainacylcoAsynthetasepalmitate+CoA+ATP→palmitoyl-CoA+AMP+PPimyokinaseAMP+ATP→2ADPpyruvatekinase2ADP+2phosphoenolpyruvate→2ATP+2pyruvatelacticdehydrogenase2pyruvate+2β-NADH→2lactate+2β-NAD＋产品内容清理液（ReagentA）120毫升裂解液（ReagentB）10毫升缓冲液（ReagentC）5毫升反应液（ReagentD）500微升酶促液（ReagentE）250微升底色液（ReagentF）250微升阴性液（ReagentG）250微升产品说明书1份保存方式保存反应液（ReagentD）、酶促液（ReagentE）和底色液（ReagentF）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（ReagentD）和底色液（ReagentF）避免光照；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器1.5毫升离心管：用于样品保存的容器细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞（微型）台式离心机：用于样品制备200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于光度分析实验步骤样品准备准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）小心加入3毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面小心抽去清理液使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g小心抽去上清液加入500微升裂解液（ReagentB），充分混匀转移到预冷的1.5毫升离心管QL涡旋震荡15秒置于冰槽里孵育30分钟放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（ReagentD）和底色液（ReagentF）避免光照缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度背景对照测定移取195微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿加入25微升反应液（ReagentD）加入12.5微升酶促液（ReagentE）加入12.5微升底色液（ReagentF）上下倾倒数次，混匀在25℃温度下孵育3分钟加入5微升阴性液（ReagentG）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－15分钟读数）样品测定移取195微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿加入25微升反应液（ReagentD）加入12.5微升酶促液（ReagentE）加入12.5微升底色液（ReagentF）上下倾倒数次，混匀在25℃温度下孵育3分钟加入5微升待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－15分钟读数）五、计算样品活性[（样品读数－背景读数）X0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.005（样品容量；毫升）X6.22（毫摩尔吸光系数）X15（反应时间；分钟）X2]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔棕榈酰辅酶A/分钟酶标仪测定在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品分别移取195微升缓冲液（ReagentC）到96孔板里分别加入25微升反应液（ReagentD）分别加入12.5微升酶促液（ReagentE）分别加入12.5微升底色液（ReagentF）轻轻摇动96孔板在25℃温度下孵育3分钟分别加入5微升阴性液（ReagentG）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）轻轻摇动96孔板即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数活性计算：[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X6.22（毫摩尔吸光系数）X0.6（光径距离；厘米）X15（反应时间；分钟）X2]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔棕榈酰辅酶A/分钟注意事项本产品为20次操作，包括背景对照操作时，须戴手套系统操作过程中，背景测定只需1次建议使用比色皿测定样品须澄清，至关重要加样后3秒内光度测定测定值由高到低变化；测定可持续15分钟光度测定后，比色皿须清洗彻底样本测定0分钟读数高于15分钟读数表明具有酶活性建议待测样本蛋白浓度为20微克/5微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度长链脂酰辅酶A合成酶单位活性定义为：在25℃，pH8.1条件下，每分钟内能够合成1微摩尔棕榈酰辅酶A所需的酶量作为一个活性单位本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品质量标准本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定检测敏感
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