细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂盒产品说明书

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细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂盒产品说明书主要用途细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂是一种旨在通过酸性加热萃取并转化为可溶性弹性蛋白，与四苯基卟吩四磺酸染料结合，在碱性条件下，释放棕红色染料，酸性处理后，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞样品中弹性蛋白含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以用于检测各种弹性蛋白，包括原弹性蛋白（tropoelastin）、致山黧豆中毒弹性蛋白（lathyrogenic）、α弹性蛋白、k-弹性蛋白等。适用于各种细胞（动物、人体等）或培养上清弹性蛋白水平检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。技术背景弹性蛋白（elastin）是一种不溶性的非极性的碱性蛋白，具有高度抗拉能力（tensilestrength），存在于大动脉、气管、支气管、韧带等结缔组织细胞间。弹性蛋白由多肽二价交联随机扭绞（randomlykinked）组成，通过锁链素（desmosine）和异锁链素（isodesmosine）相连。动物细胞上的原弹性蛋白（tropoelastin）为单体，可溶性，分子量为62至72Kd。与微纤丝（microfibril）糖蛋白结合，形成弹性基质（matrix）或弹性组织筏（raft），构成细胞膜表面。通过酸性加热萃取弹性蛋白，并转化为可溶性衍生物，α弹性蛋白、k-弹性蛋白等，进而使用四苯基卟吩四磺酸（5,10,15,20-tetraphenylporphin-21H,23H-tetra-sulfonate；TPPS）染料与弹性蛋白发生温克尔曼反应（Winkelmanreaction）结合，然后在碱性条件下释放出棕红色染料，酸性处理后，呈现绿色，通过分光光度仪（445nm波长）测定，分析弹性蛋白的含量。产品内容萃取液（ReagentA）毫升沉淀液（ReagentB）毫升清理液（ReagentC）毫升染色液（ReagentD）毫升浓缩液（ReagentE）毫升解离液（ReagentF）毫升强化液（ReagentG）毫升标准液（ReagentH）毫升稀释液（ReagentI）毫升产品说明书1份保存方式保存标准液（ReagentH）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（ReagentD）避免光照；试剂具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于标准液配制和样品制备的容器15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离平式摇荡仪：用于样品操作干式恒温仪：用于样品孵育微型台式离心机：用于样品操作200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品预处理1）细胞上清处理移取300微升细胞培养上清到1.5毫升离心管加入xx微升萃取液（ReagentA）涡旋振荡15秒放进100℃干式恒温仪孵育60分钟置于室温下15分钟冷却放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心移取400微升上清液到新的1.5毫升离心管加入xx微升4℃预冷的沉淀液（ReagentB）在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心抽去上清液，确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见置于冰槽里备用2）细胞处理准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）小心抽去培养液小心加入xx毫升清理液（ReagentC），覆盖生长表面小心抽去清理液使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）加入xx毫升清理液（ReagentC），混匀细胞移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）放进台式离心机离心5分钟，速度为300g小心抽去上清液，但保留300微升，混匀细胞颗粒群转移到1.5毫升离心管加入xx微升萃取液（ReagentA）涡旋振荡15秒放进100℃干式恒温仪孵育60分钟置于室温下15分钟冷却放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心移取400微升上清液到新的1.5毫升离心管（注意：上清液可能会呈现黄色）加入xx微升4℃预冷的沉淀液（ReagentB）在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心抽去上清液（注意：确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见）置于冰槽里备用二、标准样品配制准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至4号管分别加入xx微升稀释液（ReagentI）到1至4号管移取xx微升标准液（ReagentH）到1号管，混匀小心移取xx微升1号管稀释的标准液（ReagentH）到2号管，混匀小心移取xx微升2号管稀释的标准液（ReagentH）到3号管，混匀小心抽去xx微升3号管稀释的标准液（ReagentH）将1至4号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号稀释液（ReagentI）标准液（ReagentH）标准弹性蛋白含量1xx微升xx微升xx微克2xx微升xx微升1号管xx微克3xx微升xx微升2号管xx微克4xx微升背景读数0分别加入xx微升4℃预冷的沉淀液（ReagentB）到上述标准管里在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心抽去上清液（注意：确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见）置于冰槽里备用标准曲线测定分别加入xx微升染色液（ReagentD）到上述配制的标准液（ReagentH）里（注意：用枪头抽打使沉淀颗粒溶解）分别加入xx微升浓缩液（ReagentE）涡旋振荡混匀室温下，孵育60分钟，期间每隔15分钟涡旋振荡15秒放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心抽去上清液（注意：确保没有液体残留）加入xx微升解离液（ReagentF）用枪头抽打使沉淀颗粒溶解，并辅以涡旋震荡（注意：确保充分溶解）加入xx微升强化液（ReagentG），混匀（注意：呈现绿色）转移到新的200微升1厘米光径的比色皿或96孔板即刻放进分光光度仪或酶标仪检测（波长445nm）：获得标准样品吸光读数重复实验步骤1至11四次构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准弹性蛋白含量（微克）（注意：标准样品吸光读数背景读数）样品测定加入xx微升染色液（ReagentD）到上述配制的待测样品管里（注意：用枪头抽打使沉淀颗粒溶解）分别加入xx微升浓缩液（ReagentE）涡旋振荡混匀室温下，孵育60分钟，期间每隔15分钟涡旋振荡15秒放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g小心抽去上清液（注意：确保没有液体残留）加入xx微升解离液（ReagentF）用枪头抽打使沉淀颗粒溶解，并辅以涡旋震荡（注意：确保充分溶解）加入xx微升强化液（ReagentG），混匀（注意：呈现绿色）转移到新的200微升1厘米光径的比色皿或96孔板即刻放进分光光度仪或酶标仪检测（波长445nm）：获得样品吸光读数根据上述标准曲线获得样品对应弹性蛋白含量（微克）（注意：待测样品吸光读数背景读数）浓度计算注意事项本产品为25次操作，包括标准样品本产品检测范围为5至100微克弹性蛋白操作时，须戴手套系统操作时，标准样品测定只需1次弹性蛋白沉淀颗粒微小透明，肉眼难以看见操作需要非常细致，包括避免液体残留、颗粒溶解等，否则会产生误差试剂具有腐蚀性，严格注意操作安全孵育时，避免光照如果样品弹性蛋白含量过低，可以浓缩样品或增加样品量样品浓度可以表述为：微克弹性蛋白/细胞量；微克弹性蛋白/细胞总蛋白等通常1X105细胞含有40微克弹性蛋白本公司提供系列弹性蛋白检测试剂产品质量标准本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定检测敏感
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