斑点印迹法快速优化抗原和抗体的浓度
- 上传人: 上海易利生物科技有限公司 |大小:25KB|浏览:970次|时间:2018-12-30
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斑点印迹法快速优化抗原和抗体的浓度每一个Westernblot都涉及到抗原和抗体的相互作用,因此,抗体浓度并不是一成不变的,优化很重要。一抗和二抗浓度取决于每个抗体的特异性和抗原的特异性,以及样品中存在的抗原量。每个厂家提供的二抗特异性也不同。在改变实验参数,如更换了抗原、一抗、二抗或底物时,有必要重新优化。一、简便快速的斑点印迹步骤1、你要准备的材料硝酸纤维素膜,剪成1cm×8cm的长条包含抗原的样品,以PBS、TBS或类似缓冲液稀释一抗和HRP结合的二抗封闭液洗涤液底物工作液:HRP的化学发光底物(如SuperSignal底物)胶片或CCD成像系统二、操作步骤1.用TBS或PBS制备蛋白样品的稀释液。稀释度要取决于样品中存在的抗原浓度。由于抗原浓度通常未知,因此有必要检测宽范围的稀释度。SuperSignal底物有着皮克至飞克水平的检测灵敏度。因此样品稀释可以在微克至飞克范围。2.制备硝酸纤维素膜,用铅笔标上每个待测一抗/二抗的浓度。所需转印膜的数量取决于待筛查的一抗和/或二抗有多少种不同的稀释浓度。通常来说,一抗要检测一到两个稀释度,而二抗要检测两到三个稀释度。例如:使用SuperSignal底物,一抗和二抗可如下稀释:1/1000的一抗和1/50000的二抗1/1000的一抗和1/100000的二抗1/5000的一抗和1/50000的二抗1/5000的一抗和1/100000的二抗3.将硝酸纤维素膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。每个点的体积越少越好(1-5μl),以保证点尽可能地小。如果需要使用5μl以上的样品,在点完一次后,干燥2-5分钟,再点一次。让膜干燥10-15分钟,或直至无可见水分。4.用封闭液封闭膜上的非特异性位点,室温震荡孵育1h。5.用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释一抗,并加到膜上,室温震荡孵育1h。6.用洗涤液洗膜4次,每次5分钟,用尽可能大体积的洗脱液。7.用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释二抗,并加到膜上,室温震荡孵育1h。8.用洗涤液洗膜4次,每次5分钟,用尽可能大体积的洗脱液。9.准备底物工作液,将等体积的SuperSignalSubstrateLuminol/Enhancer溶液与过氧化物溶液混合。制备足够体积的工作液,以确保印迹点完全湿润,且印迹点在孵育过程中不会干。建议体积:0.125ml/cm2印迹。10.将膜放在底物工作液中孵育5分钟。11.将膜取出,放在塑料布或其它防护膜上。12.蛋白一侧朝上,将印迹贴到胶片上,曝光30-60秒。为获得**结果,曝光时间可能不同。如果**次曝光不够,再试试2-5分钟。另外,也可用CCD相机或其它成像仪。13.在一张优化好的印迹膜上,底物产生的信号可能会持续6-24小时,这取决于具体的产品。若结果不佳,可重新曝光。随印迹时间的延长,可能需延长曝光时间。如果仍未获得**结果,可用不同浓度的抗原和/或抗体重复以上步骤。
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