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土壤DNA提取

上传人: 上海索宝生物科技有限公司 |大小:28KB|浏览:2688次|时间:2018-09-02
土壤DNA提取
文档简介

腐殖酸的污染。土壤中,特别是森林,草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常类似,在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用,如PCR,酶切的失败。裂解方法。土壤样品中含有各种微生物,如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁,让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。由于土壤样品的复杂性,使用酶法(如溶菌酶,破壁酶,蜗牛酶)或液氮研磨都不可行,因为土壤中含有各种金属离子或YZ因子导致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。土壤DNA提取的解决简介土壤样品含有大量的微生物,其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物Z为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中,经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中,然后再进行分离提取,如Zhou的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中,如BufferPBS等,把微生物从土壤中分离出来,然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对DNA提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组),目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA可Zda可能性地获得全基因组,但是这种方法却面临以下几个问题:1.2.3.DNA得率难于控制。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成DNA得率降低。OmegaBiotek公司的E.Z.N.A.SoilDNAKit是目前土壤DNA提取Z为优化的试剂盒。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法,可不需特殊的珠磨仪,在点动涡旋仪就可进行,适合于广大的研究室。试剂盒中HTRReagent是OmegaBiotek公司du家开发的腐殖酸吸附剂,能GX去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式,可GX去除土壤中各种可溶性金属盐,以及其它可溶性的YZ因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈):自然保护区森林的土壤(长达30-40年森林土壤,表层有30-50cm落叶层),红树林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,矿石区泥土,有机物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空调管道堆积物等。实验方法为表明该试剂盒的优势性,我们选择以下不同组织样品进行DNA提取实验,每个样品重复3次。l森林类样品:自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区)和海南岛红树林保护区l矿石区样品:矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干)l耕地样品:稻田土壤,菜地土壤l有机物污染地表样品:污水沟衍泥和生活垃圾堆放区操作方法(按SoilDNAKit试剂盒进行)简单描述以下:1.取▲0.5g森林土壤/耕地土壤,或◆4g矿石区土壤和有机物污染土壤至15ml离心管中;2.加入▲0.5g酸洗玻璃珠,或◆4g酸洗玻璃珠;3.加入▲1mlBufferSXLMLus,或◆8mlBufferSXLMLus;4.立即在涡旋仪上Z高速涡旋3分钟。5.加入▲100ul,或◆800ulBufferDS,涡旋15s混匀6.转移至预热至70oC水浴锅中,水浴10-15分钟。7.3000xg离心3分钟,转移▲800ul,或◆7ml上清,并加入▲270ulBufferSP2或◆2.3mlBufferSP2,涡旋混匀;8.▲10,000xg离心5分钟,或◆5,000xg离心10分钟;9.把上清液转称至新的2ml/15ml离心管中,加入0.7倍的异丙醇。(在处理矿石区样品时和有机物污染的样品中,还加入133ul糖原溶液),涡旋混匀;10.▲10,000xg离心5分钟,或◆5,000xg离心10分钟沉淀收集DNA。11.倒弃上清液,并反扣于吸水纸上5分钟;12.加入200ulElutionBuffer,涡旋5秒。65℃水浴20-60分钟,让DNA充分溶液。13.加入50ulHTR,反应2min后,离心,取上清。14.上清加入等体积(约200ul)XP2Buffer,均匀后上柱。15.加入300ulXP2Buffer,洗涤一次。16.加入700ulSPWWashBuffer,洗涤两次。17.空甩后,加入适当量的ElutionBuffer洗脱即可。实验结果1.DNA电泳结果取10ul纯化的基因组DNA上样于0.8%琼脂糖凝胶,80V电泳30分钟,结果如下。0.5g森林类土壤样品(前两个自然保护区森林土壤,后两个为红树林土壤)0.5g耕地类土壤样品A:水稻田土壤B:玉米土壤4g有机物污染土壤样品A:生活垃圾堆放地B:污水沟底泥4g矿石泥1和3是两个矿石区水底土壤(湿)2和4矿石区地表土壤(干)相关附录【omega】基因组DNA抽提试剂盒系列 Se全血DNA小量提取试剂盒:从小于1ml血液样品中纯化2-30ug淋巴细胞基因组DNAD3471-00SEBloodDNAKit(20)150D3471-01SEBloodDNAKit(50)300D3471-02SEBloodDNAKit(200)1000全血DNA小量提取试剂盒:从小于250ul血液样品中纯化2-30ugDNA,包括寄生的病毒等基因组DNAD3392-00BloodDNAKit(5)108D3392-01BloodDNAKit(50)720D3392-02BloodDNAKit(200)2610全血DNA中/大量提取试剂盒:从小于10ml、20ml血液样品中纯化200-250ug或400-600ug基因组DNAD3494-01BloodDNAMidiKit(10)495D3494-03BloodDNAMidiKit(50)2250D3494-04BloodDNAMidiKit(100)4320D2492-01BloodDNAMaxiKit(5)450D2492-02BloodDNAMaxiKit(20)1710D2492-03BloodDNAMaxiKit(50)3600
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