细胞冻存及复苏

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细胞冻存及复苏细胞冻存及复苏（慢冻快融）细胞冻存及复苏（慢冻快融）一、材料：材料：、0.胰酶。1、试剂：冻存液（90%FBS+10%DMSO）2、用品：冻存用：吸管（直、弯）、冻存管、血细胞计数板、显微镜、-80℃冰箱。复苏用：烧杯、温度计，细胞培养常规试剂及器材。25%二、方法：二、方法：1、冻存：取细胞90%融合的培养瓶，弃去培养液，加入0.胰酶0.消化2～3min，镜下观察，待细胞皱缩变圆后倒去胰酶，以冻存液1.～2ml中和以中止消化。吹打瓶底的每一个角落，注意不要产生气泡。待细胞基本全部吹打下来后，将吸管插入液面下，反复吹打20～30次，以制成单细胞悬液。将细胞转移至冻存管中，在4℃放置30min，-20℃放置2h预冻，以多层脱脂棉充分包裹后放入-80℃冰箱中保存。2w后可去掉包裹继续冻存。注意：细胞浓度细胞冻在一管中。注意：细胞浓度>106/支，可将2瓶75ml细胞冻在一管中。支2、复苏：取冻存管，立即投入39℃水中使之融化。放入无菌室后，外壁消毒，吸出冻存液以十倍培养液稀释，接种于培养瓶中。加培养液的时候要缓慢的加入，以减少渗透压的急剧变化造成细胞的死亡。如离心：先将培养基加入离心管大约8ml，然后将细胞冻存液滴在培养基液面上，然后离心，因为细胞重，被离心到底部了，而DMSO都还是在上清液里面，弃上清，重悬细胞加入培养瓶培养。55ml25%三、三、注意事项：注意事项：1、细胞冻存：、细胞冻存：（1）**时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好。不要选择细胞状态不好时冻存（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变）。6（2）细胞浓度：冻存时细胞浓度低于1～5×10/ml时复苏很难成功。可以离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）（3）盖子要紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。（4）选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。单薄的冻存盒因壁太薄，细胞会被迅速降温。（5）不要在-80℃放置太久，时间不宜超过半年。（冰箱的温度难以恒定：开门/关门，电压不稳等），应尽快转入液氮。（6）应保证细胞全部浸在液氮液面下。（7）每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。2、复苏：、复苏：（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。（2）水浴时间不可太长：适当提高水浴温度（37度～40度），要是冬天，就选用保温盒。（3）冰盒内时间不宜太长：复苏1h内应加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）。（4）有些细胞复苏后一星期才有起色，不要换液，耐心等待两周后再做决定
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