膜片钳

介绍

膜片钳技术是通过微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，用千兆欧姆以上的阻抗使之封接，在电学上分隔和电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）以及其周围，在此基础上固定点位，对这膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。

测量回路的核心部分是使用场效应管运算放大器构成的I-V转换器。当场效应管运算放大器的正负输入端子是等电位，向正输入端子施加指令电位时，因为短路负端子以及膜片都可等电位地达到钳制的作用，字膜片微电极与默片之间形成10GΩ以上封接时，其间达到Z小的分流电流，横跨膜片的电流能够1**%作为来自膜片电极的记录电流（lp）而被测量出来。

Neher和Sakmann由于这一伟大的贡献而获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。

发展历史

该技术是根据电压钳（voltageclamp）发展而来的，后来经过Hodgkin和Huxley成功地在神经纤维动作电位的研究中被应用。它的设计原理为以离子作跨膜移动形成了跨膜离子电流（I），离子通过膜的难易程度即是通透性，膜电导（G）即是其膜电阻（R）的倒数。所以，当

膜对某种离子通透性增大时，膜电阻就会变小，即是膜对该离子的电导加大。根据欧姆定律U=IR，即I=U/R=UG，因此，仅仅需要在固定膜两侧电位差（U）时，测出的跨膜电流（I）的改变，就能够了解膜通透性的改变情况。

1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann用双电极对青蛙肌细胞进行钳制膜电位的时候，diyi次记录到ACh激活的单通道离子电流，从而发现了膜片钳技术。

1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），不仅实现了记录时噪声的大大降低了，而且完成了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。

1981年Hamill和Neher等改进了该项技术，他们引进了膜片游离

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种根据记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。生命科学研究因为它和基因克隆技术，获得了巨大的前进动力。

技术原理

膜片钳技术是以玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜利用负压吸引封接起来，因为电极与细胞膜的高阻封接，使得从电学上隔离了电极笼罩下的那片膜与膜的其他部分，所以这片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，以一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就得到单一离子通道电流。

膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学的变革产生了巨大的意义。这种技术是根据记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个）的离子通道分子活动。自然将细胞水平和分子水平的生理学研究因为这种技术的出现联系在了一起，与此同时，又融汇了神经科学的不同分，使得以前各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端的到改变。

常规与全自动膜片钳技术对比

膜片钳技术是研究离子通道的Z重要的技术，被叫做研究离子通道的“金标准”。如今膜片钳技术已由常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。

传统膜片钳技术每次仅能记录一个细胞（或一对细胞），实验人员劳动强度大，劳动时间长。对于药物开发初期和中期对于大量化合物的

筛选和记录大量细胞的基础实验研究非常不适用。全自动膜片钳技术对于这些问题很好的解决了。它不但通量高，能够一次记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，避免了实验人员操作的复杂与困难。膜片钳技术的工作效率因为全自动膜片钳技

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种根据记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。生命科学研究因为它和基因克隆技术，获得了巨大的前进动力。

研究对象

膜片钳技术不仅适用于对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究，而且还适用于对可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制、离子泵和交换体的研究等。

操作步骤

（1）膜片微电极的制作

拉制

使用拉管仪拉管仪将玻璃毛细管拉制成为膜片微电极。

涂硅酮树酯

在微电极的Z以外的部分涂上硅酮树酯，之后其通过加热镍铬电阻线圈以便烘干凝固。

热刨光

为了提高巨阻抗封接的成功率，在显微镜下将微电极靠近热源进行热刨光处理

充灌微电极液

需要通过空滤膜过滤用于灌充微电极的液体，从而除去巨阻抗封接形成的灰尘。

（2）巨欧姆阻抗封接

（3）单一离子通道记录

（4）全细胞记录

（5）制真菌素穿孔膜片钳法

（6）膜片电容测定法

（7）参数补偿

标本种类

有各种各样的标本可以提供使用，从Z早的内分泌细胞、肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）和神经元发展到胃壁细胞、上皮细胞、血细胞、肝细胞免疫细胞、精母细胞、耳窝毛细胞、内皮细胞等多种细胞；

从培养细胞（包括细胞株）以及急性分散细胞发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从青蛙、蝾螈、爪蟾卵母、蜗牛细胞发展到鸡细胞、人细胞、大鼠细胞等等；从动物细胞发展到真菌、植物以及细胞细菌。除此以外膜片钳技术在平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上也得到了广泛的应用。

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。

传统膜片钳技术优点：

1.对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率，信息含量大。

2.灵活性好，既可以改变细胞膜电位，又能够控制改变细胞内外溶液的成分。

3.应用广泛：能够分析检测一切离子通道类型。

4.可以记录到pA级电流的变化以及单通道开关状态，所以具有非常高的灵敏性。

5.与荧光标记与反射性标记等手段相比具有更加高的精确性和权威性。

传统膜片钳技术缺点：

1.仅可以对单通道进行操作，通量低，不能够对细胞之间的通信与细胞网络进行研究，难以方便的换取细胞內液。

2.在检测的过程中，因为通道表达少而导致丢失数据点造成数据不准确，需要大量的进行实验。

3.要求操作者需要极高的实验数据。

全自动膜片钳技术优点：

1.全自动膜片钳技术效率非常高，是传统膜片钳技术效率的20-300倍。

2.自动化，可以节省实验人员的很多时间和精力。如寻找细胞，形成封接，破膜等整个实验操作全都实现自动化。

3.不再需要传统膜片钳技术所需的显微镜，微操纵器，微电极拉制仪，屏蔽网，灌流、浴漕等等。

4.人为操作的误差少，获得的数据准确性高。

5.对于药物的加样设计表现优异。

全自动膜片钳技术缺点：

1.只能在悬浮细胞实验时使用。

2。仅能对全细胞模式、穿孔膜片钳模式、细胞贴附式单通道模式进行记录，而不可以对其他模式进行记录。

3.和手动膜片钳相比，仪器及耗材价格更贵。

工作原理

工作原理膜片钳是一种能够直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。它的基本原理是以一个光洁，直径约为0.5~3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触，之后对微电极另一端开口处施加适当的负压用电极的纤细开口将与电极接触的那一小片膜轻度吸入，如此在微电极开口处的玻璃边沿以及这一小片膜周边会形成紧密的封接，它的电阻能够达到数个或数十个千兆欧，这世界上就是在化学上完全隔离了吸附在微电极开口处的那一片膜同膜的其余部分，通过微电极记录到的电流变化仅仅和该膜片中通道分子的功能状态相关联。若在这一小片膜中仅仅有一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。

操作步骤：

1.打开总电源。

2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。

3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。

4.灌注玻璃电极并排空气体。

5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。

6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。

7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。

8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。

9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。

10.用完关闭仪器，并切断总电源。

注意事项：

1.为了防止尘埃、静电伤害机器，每天做实验前请用清水拖地。

2.拉制仪使用前需预热15-30min。

3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换次氯酸钠。

4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。

5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时才可关闭。

6.在放大器打开时不能用手、金属物品或其它导电的物品接触电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。

7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种根据记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。生命科学研究因为它和基因克隆技术，获得了巨大的前进动力。

以下图片是膜片钳法各种模式的模式图，细胞吸附式首先建立了单通道记录，膜内面向外和膜外面向内的模式也建立了膜内面向外和膜外面向内的模式，Z近，又分别建立了开放的细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式。在常规方法的基础上，附加穿孔膜片的模式，即是全细胞记录法，

常规全细胞模式

全细胞模式是指在细胞吸附模式上将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。

穿孔囊泡膜外面向外模式

从穿孔膜片模式  将膜片微电极向上提起，便在微电极处形成一个膜囊泡，若条件较好，此膜囊泡内既会有细胞质因子又可有线粒体等细胞器存在。

膜外面向内模式

从全细胞模式将膜片微电极向上提起可得到切割分离的膜片，因为它的细胞膜内侧面面对膜片微电极腔内液，膜外面自然封闭而对外，因此这个模式被称为膜外面向内模式。

膜内面向外模式

将从细胞吸附模式将已形成巨阻抗封接的膜片微电极向上提起时，则膜片和细胞体被切割分隔，形成膜内面向外的模式。

细胞吸附模式

对细胞膜用膜片微电极吸附，进行记录离子通道电流的模式。它的优点是在细胞内环境保持正常的条件下，能够观察记录离子通道活动。然而因为不能直接地控制细胞内环境条件，也不能确切的明确细胞内点位，因此具有不清楚膜片上的实效点位的缺点。

开放细胞吸附膜内面向外模式

机械地破坏细胞吸附模式的膜片以外的某部位的胞膜，在细胞吸附状态下经破坏孔调控细胞内液对内面向外的单一离子通道进行记录。