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RAMMP方法与离子淌度结合，打开代谢组学分析新大门！

发布：沃特世科技（上海）有限公司(Waters)

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大规模代谢表型研究需要进行准确和可重复的分析，但是当使用当前LC-MS分析方法时，大样本队列可能需要数周才能完成，且通常需要进行几批次分析。多批次数据采集可能导致分析的可重复性发生变化，由于每天信号强度的变化，批次之间会产生差异。减少整个批次运行时间可以大大提高这种再现性，同时增加实验室通量。

典型的LC-MS分析的样品循环时间大于10分钟，特别是亲水相互作用液相色谱(HILIC)需要在随后的样品注射之前延长再平衡阶段。例如，基于传统UPLC对1000个样本进行连续分析将需要几天的仪器时间。利用Rapid Microbore Metabolic Profiling (RAMMP)的研究表明，与传统的UPLC色谱相比，RAMMP检测到的总体特征数量可能会减少，然而，将RAMMP方法与结合离子淌度(IMS)工作流程的数据独立采集(DIA)策略(如HDMS^E)相结合，可以获得更高的峰值容量，并最终获得更多的检测特征。在这里，我们分析了从给药替尼酸（Tienilic acid,TA）的大鼠收集的尿液样本，以证明使用HILIC RAMMP和离子淌度质谱联合方法的好处和通量能力。

实验

样本描述

保留时间在2小时、6小时和24小时，收集16只大鼠的尿液，这些大鼠分别给药替尼酸、替尼酸异构体和0.25M trizma碱溶液作为对照剂量。将所有样品(对照品和给药品)混合10 μL制成混合样品（QC），随后在-20°C保存直至使用。在分析之前，每个样品用LC-MS级去离子水以1:10的比例稀释。

数据处理

LC-MS数据用Progenesis QI进行处理和检索。使用EZInfo (Umetrics，瑞典)进行多变量统计分析，实现峰提取，对齐并定量。使用多种数据库源(包括HMDB)进行复合搜索。

结果和讨论

为了解决表型研究中批次效应的问题，需要减少总体批次运行时间。仅仅加快色谱梯度和缩短样品周期时间是不够的，因为这将最终影响整体色谱性能，降低分析效率并从根本上降低可靠性。本研究中使用的色谱方法从传统的10分钟HILIC分析方法缩小到3.3分钟的RAMMP方法，该方法对色谱分离的影响最小。图1(i)是代表LC-MS系统适用性混合物的示例色谱图，用于比较传统UPLC和RAMMP HILIC方法。与研究样本集相关的化合物的提取离子色谱图(XIC)包括葡萄糖、1-甲基组氨酸、尿酸和肌酐等化合物，这些化合物从QC中识别出来(图1(ii))，并展示了RAMMP HILIC工作流程的实用性。

多变量统计分析(MVA)显示，在对比组大鼠和给药组大鼠之间存在明显的分离，在应用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)方法时，两组之间存在区别(图2)。为了确保在从传统UPLC切换到RAMMP时保持峰值容量，IMS作为工作流程的一部分，导致峰值容量总体增加51%。

图1. (i) LC-MS系统适宜性混合物组分对比色谱图(1 磺胺二甲氧嘧啶;2 磺胺甲嘧啶;3 亮氨酸脑啡肽)代表分别为HILIC (a)和RAMMP HILIC (b)。(ii)尿液QC中鉴定的四种内源性化合物样例的提取粒子流色谱图。

图2. TA组与Veh组尿液的多变量统计分析。

图3. 在比较IMS与非IMS数据集与RAMMP和传统UPLC时，显示检测到的特征数量增加的图形表示。在这两种情况下，特征都是根据方差系数(CV <30%)和倍数变化>2 (TA vs Veh)进行整理的。

图4. CCS与QC尿液的m/z分布。+1(紫色)和+2(蓝色)离子的电荷状态分离，实验确定的CCS值突出显示为1-甲基组氨酸(136 ?)和肌酐(120.3 ?)。这些化合物的理论预测CCS值分别为139和119.6 ?。

这与使用IMS时增加的检测数量有关(图3)。在这两种情况下都检测到很大一部分经过统计验证的相同特征，但是另外16%被确定为IMS独有的特征。使用IMS的其他好处还包括提高光谱清晰度和测量碰撞横截面积(CCS)值。图4显示了QC的CCS分布与m/z，突出了电荷状态分离和所有检测特征的CCS测定，包括肌酐和1-甲基组氨酸作为示例化合物。这些实验确定的CCS测量值与预测的CCS值相差不到5%。IMS增加峰值容量的能力提供了更高的置信度结果，包含更少的假阳性。根据Progenesis QI处理的结果，对于基于CCS数据库的化合物鉴定，识别分数平均增加了56%(图5)。

图5.堆叠条形图说明了使用DIA-IMS工作流时增加的识别分数所提供的额外信心。本文给出的TOF(蓝色)和IMS(红色)的鉴定是基于CV(<30%)、倍数变化(>2)和方差分析(p<0.05)的。

结论

一种快速HILIC分析方法已成功开发并应用于研究经替尼酸处理后大鼠尿液中的极性代谢物。使用RAMMP方法将分析时间从10分钟减少到3.3分钟，表明极性代谢物的保留和峰形保持不变，并确定了相同的统计相关特征，同时增加了通量并改善了批次间的重现性。使用离子淌度质谱数据显示出更高的峰值容量、特异性和光谱清晰度，这最终提高了对鉴定化合物的信心。

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本文链接：https://www.yiqi.com/zt2552/article_46527.html

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