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蛋白层析前样品处理中的考量点 | 过滤篇

发布：Cytiva（思拓凡）

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由于复杂生物样品粗提取的限制，粗提液一般都会含有不溶性悬浮物（生物膜片段、蛋白聚集体、未解离组织样品、血清中的溶血凝集成分等）。在蛋白层析纯化前，需要对粗提样品进行澄清预处理以去除不溶性悬浮物。澄清后的样品可以有效避免色谱柱发生堵塞，从而延长柱子使用寿命。

通过组合使用澄清过滤技术，可以有效地去除粗提取样品中的颗粒和大分子，从而获得更纯净的蛋白质样品，为后续的实验和分析提供可靠的基础。离心和过滤是实验室中对粗提液进行澄清的常用方法，一般离心或/和过滤后要尽快进行色谱层析纯化。离心可以用于除去大多数颗粒物质。对于小体积蛋白样品，可以采用10000-15000 g离心15 min。

如果离心后样品仍然不澄清，通常使用滤器过滤。一般，对于滤器的选择主要考虑以下三个方面：

孔径大小；

滤膜材质；

膜面积。

考虑滤膜孔径

滤膜孔径的选择取决于应用，常见应用的膜孔径选择如下：

如果是层析样品的过滤膜孔径选择，还要参照色谱层析填料的尺寸：

为什么层析前通常要对样品进行0.45 μm或0.22 μm的精密过滤呢？

举例，如果一个柱填料的直径是3 μm，那么流体通路(填料之间的空间)将是0.43 μm，因此需要一个0.2 μm的过滤器来防止颗粒堵塞柱子。我们可以把层析柱想象成一个装满乒乓球的大管子，球之间的空间被称为“流体通路”。如果颗粒阻塞了柱中的流体通路，将会导致不准确的实验结果。此外，层析柱堵塞时柱压将升高，会减损柱子的使用寿命。因此，有效的过滤可以防止颗粒污染阻塞色谱柱内的流体通路，延长柱的寿命，并确保准确的结果。

Tips：滤膜孔径选择的一般原则

需要目标物质透过膜孔（滤过），选择膜孔径大小为目标物质直径5-10倍以上以降低过滤阻力，提高通透性。

需要目标物质充分截留，需选择膜孔径小于目标物质直径1/3-1/5。

理论上，大小相差10倍以上的两种物质可以通过选择合适的膜孔径实现完全分离。

考虑滤膜材质

滤膜材质的选择，要同时考虑到样品特性和溶剂的化学耐受性。

针对含蛋白样品的滤膜，推荐使用低蛋白吸附的滤膜：RC膜、PES膜、改良后的PVDF膜、CA膜。NC和尼龙膜具有较高的蛋白吸附性，不适合蛋白回收应用。

另外，滤膜的选择，也要考虑膜材的化学耐受性。特定化学溶剂可能会造成滤膜上纤维或颗粒的脱落，或产生溶出，从而影响过滤效果。

针对高颗粒含量的样品，普通的单层滤膜容易发生堵塞，此时可以考虑多步过滤。比如先用孔径在0.45 μm以上的滤器用来去除大的颗粒，再使用0.22 μm的滤器降低微生物总量。或者使用带有预滤层的滤器。常见的预滤膜介质，包括玻璃微纤维、聚丙烯等。比如Whatman GD/X针头滤器，内置玻璃微纤维滤纸-GMF150，GMF150是一种多层预滤膜介质，从上至下滤纸孔径依次减小，起到梯度过滤的效果，比没有加预滤介质的滤膜相比，过滤量高达3-7倍，相对于单层的预滤介质，拥有近2倍的过滤量。

Tips：滤膜孔径选择的一般原则

实际操作过程中，外壳材质的化学耐受性也影响到产品选择。滤膜外壳一般是采用化学耐受性较好的聚丙烯或改良的丙烯酸材料制成。滤膜或外壳对溶剂的化学耐受可以参考厂家提供的化学兼容性表。

考虑有效过滤面积 (EFA)

有效过滤面积 (EFA, Effective Filtering Area) 是指暴露于液体流或空气流的可用于过滤的过滤介质总面积，通常以平方厘米 (cm²) 、平方英寸 (in²) 或平方英尺 (ft²) 表示。

与澄清的流体相比，颗粒浓度较高的流体会更快地堵塞过滤器。此时，提高有效过滤面积可以延长过滤器的使用寿命。即过滤体积越大，所需的滤器直径越大。但在选择滤器时，不单要注意过滤体积，还要留意滤器自身带来的滞留体积的影响。在处理成本高昂或异常珍贵的流体时，建议使用滞留体积低的过滤器。样品体积、有效过滤面积 (EFA) 与滞留体积之间的关系参考如下：