改善蛋白电荷异质性新策略

治疗性蛋白的酸性和碱性异质体可能表现出与中性主成分不同的体内清除率，对酸性电荷变体的调控优先于碱性电荷变体，因为许多酸性变体对功效表现出的不利影响更大，尤其是互补决定区 (CDR) 的修饰。许多研究表明酸性异质体会缩短药物的组织存留和全身清除时间，而碱性异质体则相反。因此，工艺开发中会优先减少或去除酸性异质体。

通过优化细胞培养基组分可以选择性地减少特定类型的电荷变体。如下表所示，用于调节电荷异质体的许多组分都能调节自由基水平，尤其是一些抗氧化剂和过渡金属。虽然有些过渡金属可能会显著增加电荷异质体，但其大多是细胞生长和其它翻译后修饰所需的重要辅助因子，特别是铁和铜。

众所周知，铁通过Fenton化学反应形成ROS，并增加酸性电荷异构体。此外也有研究表明，铁浓度的增加会导致蛋白药物颜色的增加，这可能是通过Fenton化学反应产生的自由基氧化蛋白，而且颜色反应的增加与酸性电荷异构体的增加直接相关。然而，在实际操作中添加铁可以改善细胞生长和提高产量。

铜可以通过各种胞内外过程影响电荷异构体，其会增加C-末端Lys，从而导致碱性异质体的比例增加，也有研究结果显示，较高的铜浓度可能通过调控细胞生长和产物产量而影响聚糖谱，从而间接减少酸性异质体。文献中的其它报道表明，铜还可能以与铁Fenton反应相似的方式产生ROS。有趣的是，同时提高铜和锰的浓度可减少Trp氧化和酸性异质体。据推测，在基础培养基中高浓度的铜离子可能会耗尽细胞培养环境中的还原剂，然后促使细胞大量吸收铜离子，其进入细胞后可减少电子传递链中电子的泄漏，从而减少总体的ROS。

调控其它细胞内过程的化学添加剂也会影响电荷异质性，尤其是糖基化和唾液酸的调控：

此外，一些添加剂（如Trp和Cys）可以作为氨基酸氧化修饰的竞争性抑制剂，从而抑制电荷异构体相关的氨基酸修饰。其他的添加剂，特别是Arg、His和Lys等氨基酸，也可以用于减少酸性和碱性电荷异构体。有趣的是，有研究表明一些表面活性剂，特别是聚山梨醇酯 (PS80) 通过提高培养基溶解度，从而产生更高的进料培养基浓度，可以提高细胞性能，减少酸性电荷异构体的产生。

综上所述，许多用于调节电荷异构体的细胞培养基组分可以控制细胞内外的ROS水平，这些组分不仅会影响电荷分布变化，还会影响其它细胞生长表现和PQA。此外，除了上述提到的细胞培养基组分或者一些添加剂可以调节酸碱电荷的分布，我们也可以通过优化工艺参数来改善酸性电荷异构体含量：

结果表明，在使用以上三种基础培养基搭配不同比例的CB 7a/7b进行CHO细胞培养中，调整CB7a/7b添加比例由常规的10:1以及逐步降低CB 7b的添加比例中，抗体酸峰水平均有不同程度的下降。在本次测试中，相比正常10:1的CB7b添加量，CHO细胞在PSL A02搭配低比例CB7b添加量的实验组中酸峰下降了近40%，因此在实际操作中，实验人员也可以调整CB 7a:7b使用量从5:1-20:1，以此来改善蛋白酸峰含量。

除此之外，PSL A01、PSL A02在提高Titer的同时也可以改善乳酸积累。在以下测试中，相比Media A乳酸一直处于不消耗的情况，PSL A01和PSL A02尤其是PSL A01能够有效降低乳酸的积累，细胞的活率也维持得更好，且Titer也高于Media A，虽然在此项目中未检测相关质量，但是由于乳酸的改善相信PSL A01中相关质量也会有一定的优势。结果表明，从活细胞密度和细胞活率来看， CHO细胞在PSL A01中生长表现优于Media A，并且乳酸积累相较Media A有很大的改善；从蛋白产量来讲，CHO细胞在PSL A01中产量较 Media A有所提升。

Chung,Stanley,Tian,et al.Industrial bioprocessing perspectives on managing therapeutic protein charge variant profiles[J].Biotechnology and Bioengineering, 2018, 115(7):1646-1665.

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