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核苷修饰：IVT mRNA 药物安全有效的关键因素

发布：赛默飞色谱与质谱中国

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胡金胜熊亮

引言

2023 年，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 因在 mRNA 核苷碱基修饰方面重要的基础性发现而荣获诺贝尔生理学或医学奖，这一发现使得开发出针对 COVID-19 的有效 mRNA 疫苗成为了可能^[1]。在 mRNA 体外转录 (In Vitro Transcription, IVT) 时掺入修饰的核苷, 如假尿苷 (Ψ)、N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 等, 可以降低其免疫原性、增强稳定性并提高产出。IVT mRNA 的核苷修饰已有广泛研究, 如核苷修饰的 COVID-19 mRNA 疫苗在较早之前已得到紧急使用授权^[2]。近期，核苷修饰在 mRNA 体外转录工艺流程中的安全性和有效性引发了行业内外的高度关注。

理论基础

2005 年，Katalin Karikó 等人首次发现将假尿苷 (Ψ) 引入 RNA 中能降低其免疫原性，并且 RNA 的免疫原性随着假尿苷 (Ψ) 引入比例的增高而降低^[3]。2008 年，Katalin Karikó 等人再次发现用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 的 mRNA 不仅能极大地降低 mRNA 的免疫原性，还能提高 mRNA 的稳定性并增强其翻译能力^[4]。2010 年，Anderson 等人进一步探究假尿苷 (Ψ) 增强 mRNA 翻译能力的原因，结果显示，含有尿苷的 mRNA 体外转录会激活 RNA 依赖性蛋白激酶 (PKR)，随后磷酸化翻译起始因子 (eIF-2α)并抑制翻译，而含有假尿苷的 mRNA 在体外转录过程中较少的激活 PKR，其翻译不会受到抑制^[5]。

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图 1 mRNA 体外转录 (IVT) 流程图^[6]

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前沿动态

2015 年，Oliwia Andries 等人证实用 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 完全替代尿苷 (U) 比用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 更能降低 mRNA 的免疫原性，且更能增强 mRNA 的蛋白表达能力^[7]。2021 年，Pedro Morais 等人通过公开数据，对比了科威瓦克 (CureVac) 、辉瑞-拜恩泰科 (Pfizer-BioNTech) 和莫德纳 (Moderna) 三家公司生产的 mRNA 疫苗有效性的差异，深入探讨了 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 对 COVID-19 mRNA 疫苗的关键性贡献^[8]。2023 年，Thomas E. Mulroney 等人研究发现 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 掺入 mRNA 能够诱导在核糖体滑动序列处发生+1核糖体移码，并通过设计一系列实验来证明 N1-甲基假尿苷诱导发生 +1 核糖体移码的作用机理及减少移码的可行方法^[9]。

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图 2 从尿苷 (U) 到假尿苷 (Ψ) 异构化及进一步甲基化的示意图^[8]（点击查看大图）

目前，通过测定起始物料和反应底物中核苷 (Nucleosides) 及核苷三磷酸 (NTPs) 的含量，可以用来判定反应进行的程度，全程监控 mRNA 体外转录反应的过程，也可以用于优化起始物料的配比，为后续工艺改进提供思路。例如，使用低稳态水平的 UTP，可以减少体外转录过程中 dsRNA 副产物的形成^[10]；采用阴离子交换 HPLC 监测 mRNA 体外转录反应，支持 mRNA 生产工艺开发^[11]。

赛默飞应用解决方案

Acclaim C30 应用于尿苷、假尿苷和 N1-甲基假尿苷的分离

1.1

仪器配置及色谱条件

液相色谱仪：Vanquish? Core HPLC 液相色谱系统，配置：泵 Quaternary Pump C，自动进样器 Split Sampler CT，柱温箱 Column Compartment C，检测器 Diode Array Detector C，数据处理 Chromeleon? 7.3

色谱柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)

流动相、流速及洗脱程序：详见应用解决方案

进样量：5 μL；样品盘温度：15 ℃

柱温：40 ℃

采集波长：260 nm；采集频率：10 Hz；

光谱采集：190-400 nm

1.2

分离谱图及数据

图 3 对照品溶液、供试品溶液叠加谱图

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图 4 6 种核苷对照品溶液分离谱图及数据

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图 5 对照品溶液连续进样叠加谱图 (n=3)

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图 6 供试品溶液分离谱图及数据

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图 7 供试品溶液连续进样叠加谱图 (n=3, 1.0 μL)

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Acclaim C30 应用于 N1-甲基假尿苷及其含磷衍生物的分离

2.1

仪器配置及色谱条件

色谱柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)

流动相、流速及洗脱程序：详见应用解决方案

进样量：2 μL；样品盘温度：15 ℃

柱温：15 ℃

采集波长：260 nm；采集频率：10 Hz；

光谱采集：190-400 nm

2.2

分离谱图及数据

图 8 N1-甲基假尿苷及其含磷衍生物对照品溶液分离谱图

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图 9 N1-甲基假尿苷及其衍生物单标定位谱图

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关于 Acclaim C30 色谱柱^[12]

3.1

Acclaim C30 可耐受 100% 水相，耐受 pH 范围为 2-8，耐受温度上限为 60 ℃

3.2

Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm 耐受压力上限为 10000 psi，推荐流速 0.2–0.3 mL/min

Tips

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参考文献：

[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2023. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/summary/

[2] 侯书婷, 于传飞, 王兰, 王军志. 体外转录mRNA药物的技术进展和应用前景[J]. 药学学报, 2023, 58(8): 2047-2058. DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0201

[3] Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H. and Weissman, D. Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165–175 (2005).

[4] Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S. and Weissman, D. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther 16, 1833–1840 (2008).

[5] Anderson, B.R., Muramatsu, H., Nallagatla, S.R., Bevilacqua, P.C., Sansing, L.H., Weissman, D. and Karikó, K. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 38, 5884–5892 (2010).

[6] Overview of In Vitro Transcription. https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/industrial/pharma-biopharma/nucleic-acid-therapeutic-development-solutions/mrna-research/overview-in-vitro-transcription.html

[7] Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, Weiss R, Sanders NN, Kitada T. N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J Control Release. 2015 Nov 10;217:337-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.08.051. Epub 2015 Sep 3. PMID: 26342664.

[8] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4; 9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071.

[9] Mulroney, T.E., P?yry, T., Yam-Puc, J.C. et al. N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting. Nature 625, 189–194 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06800-3

[10] Ziegenhals T, Frieling R, Wolf P, G?bel K, Koch S, Lohmann M, Baiersd?rfer M, Fesser S, Sahin U, Kuhn AN. Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP. Front Mol Biosci. 2023 Dec 11;10:1291045. doi: 10.3389/fmolb.2023.1291045.

[11] Welbourne EN, Loveday KA, Nair A, Nourafkan E, Qu J, Cook K, Kis Z, Dickman MJ. Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development. Front Mol Biosci. 2024 Mar 7;11:1250833. doi: 10.3389/fmolb.2024.1250833. PMID: 38516194; PMCID: PMC10955092.

[12] Acclaim C30 column - Thermo ScientificTM AcclaimTM C30 columns provide unique selectivity and superior separations of hydrophobic, structurally related analytes.

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2024-04-30

本文链接：https://www.yiqi.com/zt5210/article_47787.html

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