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干货分享 | 细胞冻存及复苏避坑指南！

发布：安倍医疗器械贸易（上海）有限公司

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细胞培养是生命科学实验中离不开的实验之一，它有广泛的应用。细胞培养可以用于研究细胞的信号转导、合成代谢、生长增殖等。细胞培养的常见实验包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等，其中细胞冻存及复苏的过程对于细胞生长状态有重要影响。

细胞冻存

细胞冻存的目的是为了减少细胞代谢，液氮（-196℃）冻存是常用的细胞冻存方法，细胞冻存时应遵循基本原则：控制降温速率，要缓慢冻存。细胞冻存时，若不加入保护剂直接冻存，会对细胞造成严重损伤。如：

局部电解质浓度改变，pH值改变，部分蛋白质变性；
细胞内冰晶形成，可引起溶酶体的损伤使溶解酶释放，造成细胞内结构成分的破坏、线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢障碍；
细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起膜通透性改变，使细胞内容物丧失；
细胞核在冷冻保存时也易受损。

为了降低在细胞冻存时对细胞的损伤，可以在冻存时加入冻存保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）（SKU：02196055）以降低对细胞损伤或死亡。DMSO作为渗透性细胞保护剂，其能够迅速穿透细胞膜进入细胞中，防止细胞内液冰晶的形成，以及防止细胞结构紊乱等。

二甲基亚砜（DMSO）结构式

研究表明，不同浓度的DMSO对细胞活力均有影响，DMSO浓度不超过10%时，对细胞的活力影响较小（如图1）。除此之外，DMSO浓度为10%时，抑菌效果能够接近100%。在DMSO中加入适宜浓度的血清，有助于解冻后提高细胞收获率和其功能活性的恢复。因此，细胞冻存时常常使用10%浓度的DMSO，可以在其中加入胎牛血清等作为保护剂，血清有助于解冻后细胞功能活性的恢复（如图2为细胞冻存流程图）。

图1. DMSO浓度与细胞活力[1]

图2. 细胞冻存操作流程图

细胞冻存注意事项

1. 应选择生长状况良好的细胞进行冻存；

2. 冻存时细胞密度不能太低，推荐密度为100-300万细胞/mL；

3. 冻存液中DMSO对细胞有所损伤，冻存过程要快，加入细胞冻存液后尽快进入降温程序；

4. 不能将细胞悬液直接放在超低温下快速冷冻；

5. DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。

细胞复苏

细胞复苏是指将冻存在液氮或低温冰箱中的细胞解冻后重新培养，使其恢复生长的过程。细胞复苏过程中，需要遵循快速融化的原则，这样可以保证细胞外结晶短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再形成冰晶对细胞造成损伤。细胞复苏后1-2天，细胞活性会逐渐得到恢复（如图3为复苏HEK293T细胞数对数值）。

细胞复苏的主要实验过程如下：

步骤1：从液氮容器或低温冰箱中取出冻存管，迅速将其浸入37℃的温水中，并不时摇动以使其尽快融化。37℃水浴时间尽可能短（1-2min），因为延长时间会增加细胞死亡率；
步骤2：当细胞完全融化后，从水浴中取出冻存管，用酒精棉球消毒外部，然后开启瓶盖；
步骤3：将细胞悬液转移到离心管中，加入适量的培养液，并进行离心，以去除DMSO和死细胞；
步骤4：离心后，弃去上清液，用新的培养液重悬细胞，并计数，调整细胞密度；
步骤5：将细胞接种到培养瓶中， 37℃静置培养。在培养初期，应注意观察细胞状态，以确保其正常生长。

图3. HEK-293T细胞生长曲线（复苏后）[2]

图4. 细胞复苏操作流程图

细胞复苏注意事项

1. 注意无菌操作，避免细胞污染，可使用支原体去除喷雾剂（SKU：093050853）提前对实验室环境，培养箱进行处理；

2. 融化细胞时，温度和时间应严格控制，以避免对细胞造成损伤；

3. 在细胞接种后，应定期观察细胞生长情况，疑似支原体污染时可使用可视化LAMP支原体检测试剂盒（SKU：0930506）检测，若发生支原体污染，可使用支原体去除试剂（SKU：0930500）及时处理。

总结

细胞冻存及复苏是细胞培养常见的实验方法，选择合适的方法以及合理的操作能够保证细胞的活性。除此之外，选择合适的冻存保护剂也是该实验中较为关键的一步，例如DMSO应当选择内毒素水平低、细胞培养级的产品，能够降低对细胞的损伤。

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参考文献：

[1] Addison CJ, Chu SH, Reusch RN. Polyhydroxybutyrate-enhanced transformation of log-phase Escherichia coli. Biotechniques. 2004 Sep;37(3):376-8, 380, 382. doi: 10.2144/04373ST01. PMID: 15470891.

[2] 杨彪,梅晰凡,刘福强.HEK-293细胞复苏培养及冻存[J].辽宁医学院学报,2007,(06):1-3.

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