ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析

内容节点: 概述; 实验/设备条件; 样品提取; 实验/操作方法; 实验结果/结论; 仪器/耗材清单

一.ELISA 标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5s/cm
1. 标本的采取和保存
大部分ELISA 检测均以血清为标本血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色血清标本宜在新鲜时检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深超过一周测定的需－20保存冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂
抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂
2.加样
加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出
3.保温
在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37经
1-2 小时，产物的生成可达顶峰为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡应注意温育的温度和时间应按规定力求准确由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置
4.洗涤
洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来可以说在ELISA 操作中，洗涤是Z主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度
洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率**在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡
5. 显色和比色
TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶YZ剂均可使反应终止这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计酶标仪的主要性能指标有：测读速度读数的准确性重复性极ng确度和可测范围线性等等优良的酶标仪的读数一般可极ng确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定
测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，**次在Z适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA 板的位置，Z终测得的A 值为两者之差（W1-W2）双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰