对食品与饲料中类二噁英多氯联苯（DL-PCBs）的确证分析

【概述】

多氯联苯（PCBs）是一组高毒性的有机氯化合物。根据氯取代数的不同，PCB存在209种同系物1。根据其结构和毒理特征，可将这些同源物分为两类。**类包括12种具有类二噁英的结构和毒性的同系物，称为“类二噁英多氯联苯”（DL-PCBs），其为本项研究的ZD。另一类占绝大多数，不具有该程度毒性，称为“非二噁英样多氯联苯”（NDL-PCBs）。

DL-PCBs已被列为持久性有机污染物（POPs），自2001年以来一直受到“关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩约”的管制，以保护人类健康和环境安全2。这些化合物主要来源于工业加工，它们可作阻燃剂、密封剂和润滑剂等3。DL-PCBs尤其值得关注，因为它们不容易降解，且可长距离迁移。DL-PCBs能够在生物体内累积，食物链上等级越高生物体接触到的DL-PCBs暴露量越高。人类主要通过摄取食物接触这些化合物，尤其是富含动物脂肪的食物4。DL-PCBs易溶于油脂而难溶于水，因而容易在脂肪组织中富集，且难以排出体内。

DL-PCBs对人类的危害使环境中，特别是食品和动物饲料中DL-PCBs的准确检测和定量变得至关重要。欧盟于2001年建立了一项监测计划，旨在限制并理想地消除二噁英和DL-PCBs在环境中的排放5，并在1883/2006号条例中规定了食品和饲料中二噁英、DL-PCBs和六种非二噁英样PCBs（NDL-PCB）的“Z高水平”（Maximum Levels, ML）。欧盟还确立了一个“干预水平”（Action Level, AL），用作特定污染源的预警。ML和Al都表示为毒性当量（Toxic Equivalence Quotients,TEQ）。以Z高毒性的2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英（2,3,7,8-TCDD）的毒性当量因子（Toxic EquivalenceFactor, TEF）为1，其它化合物的毒性折算为相应的相对毒性强度，DL-PCBs的TEF值范围0.0001（PCB77）至0.1（PCB 126）。

迄今为止，欧盟法规仍然要求采用气相色谱/高分辨磁质谱（GC-HRMS）对污染样品中的二噁英和DL-PCBs做定性定量分析，高分辨磁质谱因其灵敏度和专属性，尤其适用于低浓度水平的检测，也可用于食品和饲料中ML和AL水平的测定。然而，近年来气相色谱/三重四极杆质谱（GC-MS/MS）技术因实现了高灵敏度和高选择性分析，从而被认可用作控制食品和饲料中DL-PCBs的“Z高水平”（ML）的检测5。但对于低浓度水平的检测（即低于监管目标水平的五分之一），仍需要采用高分辨磁质谱进行6。

根据已修订的欧盟法规，当使用GC-MS/MS检测时，在欧盟法规No. 1883（2006）1、No. 252(2012）7、No.

1259（2011）8的基础上，还需满足下述具体的参数要求（使用高分辨磁质谱除外）：

1.每组四极杆的分辨率设置需大于或等于单位质量数分辨率（即足以分离相差一个质量单位的两个质谱峰的分辨率）。

2.对所有标记和未标记分析物，应使用两个离子对（母离子-子离子）进行分析。

3.同一质谱条件下（尤其是离子对碰撞能量与碰撞气压力），与计算值或测量值（标准品的平均值）相比，离子比率Zda允许偏差为±15％。

【实验/设备条件】

表1. GC和进样器条件。

四极杆的分辨率根据欧盟法规要求的大于或等于单位质量数分辨率设定（表2）。

表2.质谱条件。

【样品提取】

DL-PCB标准品（68 C CVS CS 1至CS 5）购自Wel领ton Laboratories Inc.公司，包括DL-PCBs和13 C标记物。以下食品和饲料萃取样品由西班牙巴塞罗那CSIC环境评估与水研究所提供：脂肪组织、鱼肝、鱼油、干鱼、加标的饲料样品和奶粉样品（经认证的标准物质）。采用PowerPrepTMSPE系统萃取和净化饲料基质样品，使用多层硅胶层析柱-碱性氧化铝柱-石墨碳柱净化处理牛奶、组织和鱼样品，Z后在壬烷中定容上机。

【实验/操作方法】

本实验评估了Thermo ScientificTM TSQTM 8000 Evo三重四极杆GC-MS/MS用于分析DL-PCBs的性能。实验根据DL-PCBs的检测标准，分别使用溶剂标准品、食品和饲料的基质样品对仪器性能进行了评价。同时，对比了采用TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与采用高分辨磁质谱分析的食品和饲料基质样品的结果。

TSQ 8000 Evo仪器使用电子电离（EI）在MS/MS模式下运行。数据采集时，为每个化合物选择两个选择反应监测（SRM）离子对，满足欧盟标准的要求。Timed-SRM模式下，每个色谱峰Z少采集12个点的数据。使用

AutoSRM软件自动优化所选择的SRM离子对及其碰撞能量，结果见表3。使用Thermo ScientificTMTargetQuan3.1软件进行数据处理，该软件针对处理环境监管中持久性有机污染物（POPs）的MS、MS/MS或HRMS数据而设计。

表3. DL-PCBs和13C标记物所使用的SRM离子对。

使用TargetQuan软件进行数据处理，该软件专为同位素稀释法定量分析POPs而设计。软件的定量流程基于化合物相对校正因子（或平均相对校正因子），同时包含毒性当量因子（TEF），可自动计算化合物毒性当量（TEQ），Z终测定总毒性当量值。

【实验结果/结论】

本研究使用的仪器方法基于此前使用GC-MS/MS分析PCDD/Fs的方法9。仪器方法沿用了Timed-SRM模式，与传统的分段扫描模式相比，Timed-SRM基于已知化合物的保留时间，在保留时间窗口内对目标化合物进行质谱数据采集，从而提高目标化合物的分析效率，提高仪器灵敏度，降低方法检出限。此外，通过Timed-SRM可单独设置与待测物保留时间非常接近的13 C同位素标记物的采集通道。

色谱法

使所有DL-PCB异构体得到充分的色谱分离，是可靠定性、定量分析的关键。本实验用Zdi浓度的标准品（CS1：1 pg/µL）对DL-PCBs的色谱分离情况进行评估。所有待测化合物和13C标记物均能检出，并且有良好的峰形，如图1所示，五氯联苯异构体做到了<10％的峰谷分离（图2）。

图1.Zdi浓度标准品（1 pg/µL）中DL-PCBs待测物的色谱分离。显示每个化合物的一个SRM离子对（定量离子）。

图2. CS-1标准品中五氯联苯同分异构体的色谱分离示例（1 pg/µL）。

达到目标检测限

对于DL-PCBs分析来说，达到所需的检测限对于实施常规监测方法是至关重要的。法规要求方法的定量限（LOQ）应约为“Z高水平”（ML）的五分之一5,8,9。常规二噁英分析的仪器灵敏度需考察仪器的检测限（LOD）和定量限（LOQ），对于磁质谱而言，LOD为3倍信噪比，而LOQ为10倍信噪比。

由于GC-MS/MS仪器在MS/MS模式下强大的抗干扰能力，采集得到的数据噪音很少或几乎没有，因此，需要使用其他方法计算LOD/LOQ。综合考虑内标物的回收率（60-120％）、离子比率和色谱分离情况，通过重复（n = 8）进样Zdi浓度标准品（CS1）评估仪器的LOQ值8。

在置信度99%下，综合考虑化合物浓度和%RSD值，通过T-检验计算待测物的LOQ值。试验结果表明，DL-PCBs的定量限为0.1-0.41 pg/µL，离子比率和响应因子（RFs）在±15％范围内，13C-标记物的回收率在60-120％内（图3）。TSQ 8000 Evo GC-MS/MS可分析低浓度水平的认DL-PCBs，满足法规对检出限的要求7。

图3.重复进样一系列稀释的样品计算DL-PCBs的LOQ值。数据表明，待测物的LOQ值与离子比率和响应因子值均在预期限度范围内。

响应值的线性

DL-PCB的定量是基于同位素稀释法进行的，使用RF-标准曲线计算，通过外标校正曲线计算得到的平均校正因子，对12个待测物进行定量分析1。根据标曲的五个点计算平均校正因子的偏差（RF％RSD）。实验结果表明，所有待测物的RF % RSD值都在0.8-5.6％之间，远优于美国EPA6（表4）要求的15％。

表4. DL-PCBs标准曲线的线性范围及校正因子的％RSD

样品萃取物中DL-PCBs的定量

成功进行方法验证以后，对六个基质样品中的DL-PCBs进行定量分析。所有待测样品中的DL-PCBs均观察得到zhuo越的色谱分离，且基质干扰少。图4为PCB189的色谱图示例。

图4.鱼（A）、饲料（B）和奶粉（C）样品中存在的PCB 189的色谱分离示例。

样品中DL-PCBs的含量以WHO-TEQ pg/g表示，并将结果与磁质谱（GC-HRMS）所测值进行对比。数据表明，TSQ 8000 Evo GC-MS/MS可测的DL-PCBs浓度范围非常宽，Z重要的是，其结果与磁质谱所测结果始终保持一致（图5–10）。

图5. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析饲料中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图6. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析牛奶中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图7. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析鱼肝中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图8. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析鱼油中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图9. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析鱼干中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图10. TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）对比分析脂肪组织中DL-PCBs浓度（以TEQ pg/g计）。

图11显示了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS与高分辨磁质谱（GC-HRMS）所测每个样品中的总DL-PCB浓度偏差（均小于3％）。虽然GC-MS/MS系统能够满足常量分析要求，但高分辨磁质谱（GC-HRMS）的检出限更低，更适合低浓度水平的研究。

图11.六种基质类型采用TSQ 8000 Evo与采用GC-HRMS测得的总DL-PCB浓度值（pg/g）的偏差（％）。所有结果均与HRMS的分析

离子比率丰度

将待测样品中12个DL-PCB的离子比率（IR）与标准品（CS1–CS5）所测离子比率的平均值相比，结果表明，所有化合物的离子比率偏差均小于15％，符合欧盟法规要求（图12）。此外，SRM的高选择性，足以满足定性分析要求。

图12.对比样品萃取物中12个DL-PCB的离子比率丰度与根据校正标准品（CS1-CS5）测得的平均IR值。

结论

实验结果表明，TSQ 8000 Evo GC-MS/MS作为DL-PCBs常量分析的有效工具，完全符合欧盟关于食品和饲料样品中DL-PCBs分析的所有要求。

• TSQ 8000 Evo GC-MS/MS仪器依靠其高灵敏度和高选择性，可对食品和饲料样品中的DL-PCBs进行可靠的定性、定量分析。

• TSQ 8000 Evo GC-MS/MS结合TRACE 1310GC和TargetQuan 3.1数据处理软件，一起构成了复杂样品中DL-PCBs分析的综合解决方案。

•标准品和基质样品的实验结果均展现出zhuo越的重现性、线性、灵敏度和选择性。

•基质样品中的DL-PCB计算值与采用高分辨磁质谱（GC-HRMS）所测值非常一致。

【仪器/耗材清单】

采用TSQ 8000 Evo三重四极杆GC-MS/MS仪器与Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC联用技术分析标准品和基质样品中的DL-PCBs。采用Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH自动进样器进样，并在Thermo ScientificTM Trace GOLD TG-5SilMS 60 m×0.25 mm I.D.×0.25 µm色谱柱上进行化合物分离。

【参考文献】

1. European Commission, Commission Regulation No.1883, Off.J. Eur.Union, 2006, L 320, 18–23.

2. European Commission, Commission Regulation No.850, Off.J. Eur.Union, 2004, L 158, 7-49.

3. Travis, C.C, Hattemer-Frey, H.A.Human exposure todioxin.Sci.Total Environ.1991, 104, 97–127.

4. Fries, G.F.A review of the significance of animal food products as potential pathways of human exposuresto dioxins.J. Anim.Sci.1995, 73, 1639-1650.

5. European Commission, Commission Regulation No.102, Off.J. Eur.Union, 2002, L6, 45–49.

6. Kotz A.; Malisch R.; Focant J.; Eppe G.; Cederberg Tommy Licht; Rantakokko P.; Fürst P.; BernsmannT.; Leondiadis L.; Lovasz C.; Scortichini G.; Diletti G.;di Domenico A.; Ingelido A. M.; Traag W.; Smith F.;Fernandes A. Analytical criteria for use of MS/MS for determination of dioxins and dioxin-like PCBs in feedand  food.Organohalogen Compd., 2012, Vol. 74,156–159.

7. European Commission, Commission Regulation No.252, Off.J. Eur.Union, 2012, L 84, 1-22.

8. European Commission, Commission Regulation No.1259, Off.J. Eur.Union, 2011, L 320, 18–23.

9. Thermo Scientific应用文档10380：Meeting the European Commission Performance Criteria forthe Use of Triple Quadrupole GC-MS/MS as aConfirmatory Method for PCDD/Fs in Food andFeed Samples.Runcorn, UK.[Online] http://www.thermoscientific. com/content/dam/tfs/ATG/CMD/CMD%20Documents/ Application%20&%20Technical%20Notes/Mass%20 Spectrometry/GC%20MS/AN-10380-TSQ-8000-EVO-PCDD-FS-AN10380-EN.pdf (accessed Aug. 3, 2015)