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赛默飞GC-MS对威士忌酒进行化学轮廓描绘和示差分析

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内容节点
概述
实验/设备条件
样品提取
实验/操作方法
实验结果/结论
仪器/耗材清单

【概述】

威士忌酒是一种常见的烈性酒。其蒸馏工艺历史悠久、源远流长,其中还涉及非常复杂的陈酿过程。具体来说,要先将多种谷物和水混合制成酒浆并利用酵母进行发酵,再进行蒸馏,然后还要在木桶或酒桶中进行陈酿。1经过这种复杂的传统工艺处理的成品酒的酒精含量很高,不过批次间的差异也巨大。举例来讲,产自苏格兰岛西海岸的威士忌酒通常带有浓重的烟熏味,而产自斯贝塞区的酒则富有蜂蜜,香草的香甜和浓浓果香。2制酒技术通常会对酒的化学组成产生重要影响,从而影响Z终成品酒的风味。


正是由于这些独特之处,加之其需求的不断增长,威士忌酒已经成为世界上很多地区的重要商品。而整个威士忌酒业也成为这些地区的雇佣主体和税收支柱。举个例子,对于英国经济来说,威士忌酒业的市场价值约为50亿英镑,3而整个烈酒市场在美国的价值总和约为1200亿美元。4由于威士忌酒零售价格普遍较高,市面上充斥着大量伪劣商品,对威士忌酒业的生存和发展构成相当大的威胁。造假的手段五花八门,规模大小不一。Z普遍的一种方式是将威士忌酒的主要已知化学成分加入某种低价烈酒中,以这种“人造产品”冒充威士忌。这种方式也Z令人担心,因为造假者根本不可能规范控制化学物质添加的种类、质量和浓度。


另一种造假的主要形式是以次充好,夸大威士忌酒陈酿的年数。因为威士忌的颜色深度跟陈酿的年数正相关,造假者会在酒中添加色素或在陈酿过程中加热以模仿陈酿的色泽,或在灌装时故意使用不相符的标签来夸大陈酿的年数来在市场上谋取暴利。这两种造假的方法都能够快速地在数月甚至数日之中得到正常需要数年才能得到的酒品外观。


因此,对威士忌酒酿造商来说,能够使用现有的分析技术准确、全面地表征他们的产品至关重要,因为这样有助于对假货的准确识别和整治,使得他们能够有效地保护自己的产品和品牌。此外,对于威士忌酒酿造商来说,把产品的化学轮廓描绘分析纳入质控流程的好处还不止于此。因为化学轮廓分析的结果还有助于他们比较不同批次产品的差异,及时发现酿造过程中出现的变化。这样一来,他们就能更有效地保证他们灌装的成品酒品质始终如一,符合消费者期待的特色风味和特征。

【实验/设备条件】

表2. GC和进样器条件

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表3.质谱仪条件

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【样品提取】


本研究中共包括了九种威士忌酒样品,样品详细信息参见表1。为GC分析进行的样品前处理程序如下:将3 mL威士忌酒样品与10 mL蒸馏水混合,再加入15 mL乙酸乙酯振荡,将有机相通过3 g硫酸钠。在室温下借助温和氮气流吹干乙酸乙酯萃取液,再用0.5 mL乙酸乙酯重悬并转移至GC样品瓶内。

将每种酒的萃取液取50 µL在GC样品瓶中进行混合,制成复合样品以进行统计分析。此外,以空白乙酸乙酯样品作为对照,以排除背景中存在的峰。对每个样品,包括复合样品,以随机顺序进行四次重复进样分析。

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表1.研究涉及的威士忌酒样品详细信息


【实验/操作方法】

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)被广泛用于的威士忌酒表征分析,因为它具有色谱分辨率好、重现性高、峰容量高等优点,尤其是成熟的GC-MS数据库能非常有效地帮助实现酒中挥发性和半挥发性化学成分的鉴定。在本概念验证性研究中,我们希望利用Thermo ScientificTM ExactiveTM GC混合四极杆-OrbitrapTM质谱仪出色的分析表现来对不同产地、年份、和类型的威士忌酒进行轮廓描绘分析。


本研究的另一个目标是对使用Q Exactive GC系统,通过一个完整的非定靶化学计量工作流程,进行威士忌酒中化学成分的检测和鉴定的方法和效果进行评估。本文中也可见不同产地威士忌酒的化学成分存在差异。

样品分析在高质量分辨能力下使用全扫非定靶采集方式进行,以获得极ng确质量数据。这些数据对于实现元素组成分析、区分样品与共洗脱等质量干扰化合物非常重要。高扫速与大动态定量范围和高灵敏度的组合使得检测高、低丰度的成分都易如反掌。这些特性与独特软件算法的结合能够支持自动解卷积,并完成数据的解析和样品对比,为酒品的全面分析、质量控制、和品牌管理保护提供了强大的工具支撑。

【实验结果/结论】

验证性研究的目的是使用非定靶全扫数据采集法分析威士忌酒样品、使用统计工具鉴定样品间是否存在差异,并初步鉴定出所有观察到的差异物质。此外,另一个目的是通过极ng确质量数推理和谱图匹配对每个样品进行化学成分表征。图1总结了达成这些目标所需的工作流程。

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图1.用Q Exactive GC系统进行化学轮廓描绘和标志物鉴定的工作流程


发现样品间的差异

对每个样品进行四次重复进样分析并获得全扫色谱图。图2给出了一份单一纯麦样品和一份波本威士忌酒样品的总离子流图(TICs)实例,图中可见大量不同强度的峰出现在各个保留时间。对化学轮廓描绘分析来说非常重要的一点是,Q ExactiveGC系统的动态定量区间范围非常大,使得同时准确捕捉痕量成分和高浓度成分成为可能。用SIEVE 2.2软件处理全部数据,包括9份样品、复合样品、和重复分析的数据,进行组分提取和统计分析。软件会首先进行色谱峰对齐操作以校正分析间的保留时间漂移,然后再进行谱峰检测和Z后的统计分析。分析结果参见图3,图中显示的是对所有样品和重复分析结果进行主成分分析(PCA)的结果。目测来看,每份威士忌酒样品的重复分析数据显然聚类在一起,而混合样品如预期般位于PCA图的ZX位置。

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图2.纯麦威士忌酒(样品2265)和波本威士忌酒(样品2295)的GC-MS总离子流谱图.

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图3.将9份威士忌酒样品进行4次重复分析的数据由SIEVE软件进行主成份分析所得模型。请注意,所有的重复分析数据都正确地聚类在一起。而威士忌酒样品2295(波本威士忌)和2265(在三个酒桶中进行过陈化)虽然与其它样品明显不同,但彼此却有相似之处。

分离独特成分

基于PCA分析结果和SIEVE 2.2生成的谱峰列表,我们可以分析不同样品类型之间的差异主要是由哪些峰造成的。从

PCA分析中得到的一个有趣结果是样品2295和2265与其它样品明显有差异。对含有4841个组分的列表(包含保留时间和相应的极ng确质量数)根据p值(<0.05)进行排序以保证统计上的显著性,结果有效揭示出样品2295中有大量特有化合物和这些化合物浓度显著升高、并且在四份重复分析中显示出一致的组分峰。我们对统计差异位列前五的谱峰进行了分析,结果参见表4。


具体来说,如SIEVE 2.2的强度变化趋势图(图4)所示,首先发现保留时间13.6分钟处的谱峰在样品2295中显著高于所有其它样品。下一步是根据极ng确质量数推测元素组成,尝试鉴定出组分峰化学结构。这一步可能会非常困难,同时使用EI谱图和PCI谱图会有些帮助。还可以用EI谱图去搜索诸如NIST等商用谱图数据库以得到可能的化合物,并使用准确质量信息来支持或排除鉴定结果。如果EI谱图搜不出结果,可以用PCI数据推测分子离子可能的元素组成。的质量准确度对于缩减可能的化学分子式列表和提高鉴定结果的可靠性至关重要。

表4.样品2295中浓度升高的五个谱峰及其可能的鉴定结果总结表

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为简化13.6分钟处谱峰的鉴定,将原始数据用TraceFinder软件解卷积化生成一张更为“干净”的谱图,然后再与NIST 14进行搜索匹配(图5)。搜索NIST谱库所得结果再根据正匹配指数(SI)得分和高分辨过滤分值(HRF)进行评分。HRF值实际上就是搜库所得化学分子式所能解释的谱图比例。以**结果反式β-紫罗兰酮为例,谱图中高达98.4%的内容都可以根据离子的准确质量找到解释。谱图中观察到的碎片离子也都可以匹配到推断化合物的结构单元上,更提高了鉴定结果的可信度,也有助于解释这些碎片是如何在推测化合物的基础上形成的。Z后SI和HRF的综合得分为75.3%。图6显示的是EI谱图中的碎片离子峰,图中标记出了推测分子元素组成和质量偏差。所有碎片离子的实测值和理论值之差都在小于1 ppm,使得结果更为可靠。反式β-紫罗兰酮是胡萝卜素的裂分产物,其浓度在样品2295(波本威士忌酒)中有显著升高。波本威士忌和苏格兰威士忌的一个重要区别在于,波本威士忌是用玉米而不是大麦酿制的。玉米中天然β-胡萝卜素的含量高于大麦(玉米含量为53 µg/200 g,大麦含量为7 µg/200g5),因此检测到的浓度差异可以在这里找到解释。

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图5. 13.6分钟处的峰被鉴定为反式β-紫罗兰酮。TraceFinder 3.3中解卷积化数据及谱库搜索结果的截屏图。谱库搜索结果列表,排**的结果,反式β-紫罗兰酮,能解释75.3%的谱图内容(上图)。实采谱图与数据库谱图的镜像比较图(下图)。

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图6.标记了分子式和质量偏差(ppm)的反式β-紫罗兰酮EI碎片谱图。分子离子和前六个强度Z高的碎片支持鉴定结果,质量准确度< 1 ppm。R =分辨率。

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image.png图7. 18.00分钟处谱峰的EI图,谱库搜索未产生匹配结果。图中标注出了每个峰的结构、分子式和质量偏差(ppm)。质量偏差小于1 ppm,使得鉴定结果,3-羰基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸,高度可信。谱峰注释根据Mass Frontier 7.0中生成的结果进行。

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图8. SIEVE软件对同一酿酒厂不同陈化年份的威士忌酒生成的PCA图。重复进样分析结果一致。


产自同一酿酒厂的威士忌酒间的差异

对本次研究产生数据的进一步分析是比较同一间酿酒厂出产而陈化年份或陈化过程不同的威士忌酒之间的差异。使用SIEVE软件对样品2263(12年)、2264(18年)、和2265(未标明年份,但已知是在三个不同的酒桶中进行过陈化)的重复分析数据进行分析,PCA结果显示这三份样品间存在明显差异,而重复进样分析的结果则一致(图8)。

在TraceFinder软件中能够迅速分离出造成这些差异的化合物:通过用热图形式展示解卷积化的谱峰列表(图9),样品间峰高的差异一目了然,可以轻松挑选出研究者感兴趣的谱峰。

TraceFinder根据谱图匹配和极ng确质量对推测的化合物列表进行排列,鉴定结果为羟甲基呋喃醛(图10)。具体来说就是该软件先根据推测化合物结构能够在极ng确质量层面解释多少谱图内容进行评分,当搜索指数(> 600),Z后按这两个参数排序找到Z吻合的结果。威士忌酒中出现羟甲基呋喃醛(HMF)并不令人意外,因为该化合物是糖脱水的产物。6,7样品2265曾在三个不同的酒桶中进行陈化,其中包括曾酿过高糖分的雪莉酒和波本威士忌的酒桶,因此其中羟甲基呋喃醛浓度高企很可能是由于威士忌酒与酒桶内表面相互作用造成的。尤其是已知波本威士忌橡木酒桶的受热碳化会导致HMF浓度的升高。

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结论

验证性研究的结果显示,使用Thermo Scientific Q ExactiveGC混合四极杆-Orbitrap质谱仪与TraceFinder和SIEVE 2.2软件组合能够非常有效地对复杂样品进行化学轮廓描绘分析。Orbitrap质谱仪能够实现样品中所有组分的高质量准确度检测,使得对样品快速、可靠、不局限于组分浓度的表征成为可能。

•可靠、高度重复性的色谱分离与高速数据采集能力的组合使Q Exactive GC系统成为一个进行复杂样品化学轮廓分析的理想平台。

•常规保证的60,000 FWHM分辨率与足够宽的定量动态范围消除了质量数相同(低分辨质谱不能分辨)物质干扰的烦恼,加之稳定的1 ppm以内的质量准确度和的灵敏度,大大提高了复杂基质中化合物鉴定结果的可靠度。

•SIEVE 2.2与TraceFinder软件使得快速、全面的威士忌酒样品表征易如反掌,化合物分离鉴定结果准确可信。

•EI和PCI数据可以用来搜索商用谱库并进行初步的化合物鉴定分析。而当谱库搜索无果时,准确质量数据也使得推测元素组成有根有据。而推测的鉴定结果也能够在Mass Frontier7.0中根据碎片离子的准确质量快速进行确认或排除。

【仪器/耗材清单】

所有实验均使用Q Exactive GC系统进行。进样使用Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH自动进样器,色谱分离使用ThermoScientificTMTriPlusTM1310 GC,搭配Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 30 m×0.25 mm I.D.×0.25 µm薄层毛细管色谱,带10 m预柱(P/N 26096-1425)。



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