【兰州大学叶为春教授课题组】SERS光谱定量检测苯二氮卓类药物总量的研究

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激光共聚焦显微拉曼光谱仪|SERS光谱定量检测苯二氮卓类药物总量的研究
苯二氮卓类药物（Benzodiazepines, BZDs）属于中枢神经系统药物，具有抗焦虑、抗癫痫、抗惊厥、催眠等药理作用具有较好的疗效。由于BZDs结构相似，疗效类同，很多BZDs的治疗量与中毒量、致死量相接近，过量使用易引起中毒乃至死亡。此外，许多麻醉抢劫、麻醉强奸案件都有涉及这类药物。然而，由于BZDs在体内的浓度随代谢过程逐渐降低，很多刑事案件检材，特别是药物在血、尿中已含量甚微，难以被检测。因此，建立简单、快速、灵敏、准确的检测方法，用于快速定量筛查体液(血、尿)中痕量BZDs的总含量是十分必要的，对促进医疗用药及刑事侦查的发展具有积极的意义，也是很有挑战的课题。

相比于传统的高效液相色谱和LC-MS方法，表面增强拉曼光谱(SERS)具有超高灵敏度，且可直接给出被检分子的结构信息，还具有快速、无损的特性，在生化样品分析中具有独特的优势。实现SERS检测的关键在于SERS基底的构建。传统贵金属(Ag, Au)SERS基底尽管SERS活性高，但其价格昂贵，不利于商业化应用。目前比较普遍的做法是在半导体氧化物(ZnO, TiO2)上负载少量贵金属纳米粒子，其增强机理不仅有贵金属本身的电磁(EM)增强机理，还具有贵金属与半导体氧化物间的电荷转移(CT)增强机制，进而增强SERS活性，提高检测的灵敏度。此外，贵金属晶面对SERS活性也有重要的影响，特别是本课题组采用置换反应合成了Ag(111)晶面取向生长的大尺寸Ag纳米片，这种Ag纳米片由于晶面取向的优势在检测罂粟碱时表现出高SERS活性和选择性。显然，目前的合成方法制备半导体氧化物-贵金属纳米复合材料虽有助于减少贵金属用量，但也失去了晶面取向带来高SERS活性的优势。因此，如何既保持贵金属晶面取向优势，又实现与半导体氧化物间的CT协同增强机制，是本工作重点解决的课题。

该研究在课题组合成大尺寸Ag纳米片的基础上，采用化学修饰方法在Ag纳米片上生长ZnO纳米粒子，对其结构、组成和形貌进行表征。通过对ZnO纳米粒子负载量的优化实验发现，只有合适的ZnO负载量(17.5 wt%)才有SERS性能，且具有高SERS检测稳定性和均一性(图1)。基底在空气氛围环境中放置30天，其SERS强度仍保持初始强度的93％，优于纯Ag纳米片的81％。如果在Ag纳米片表面修饰非半导体氧化物(SiO2)时，其SERS信号强度随SiO2负载量单调性下降，这充分说明Ag与ZnO间CT协同机制的存在。除一系列实验(XPS,光电流测试和CT增强程度PCT的计算等)分析外，还应用分子动力学模拟(MD)计算分析了作用在该基底上的探针分子键能变化，发现当ZnO 修饰密度为0.106 NPs /nm2时基底与探针分子的键能最大(-19.1 eV)，为分析Ag与ZnO间的CT增强机制提供理论依据 (图2)。
图1：Ag纳米片表面负载ZnO纳米粒子的表征。
图2：基于Ag-ZnO-探针分子间CT增强机理的研究

在上述基础上，优化后的Ag NS/ZnO基底应用于艾司唑仑（EST，为传统BZDs药物）的灵敏检测，线性范围为10-9至10-3 M，检出限低至0.5 nM, 优于文献报道的HPLC、电化学及ELISA等经典方法的结果；表现出优异的选择性，即使分别加入100倍以上浓度的无机盐、有机物、氨基酸和其他药物等，都没产生明显的干扰。通过在人体尿液、牛血清蛋白中加标回收实验，获得满意的回收率和RSD值(≤3.71％)，表明该基底在EST的检测应用中具有很好的可靠性 (图3)。
图3：SERS检测单一药物EST含量的线性图及其抗干扰性。

进一步应用于5种BZDs药物总量的快速检测，包括EST、奥沙西泮(OXA)、阿普唑仑(ALP)、三唑仑(TRI)和劳拉西泮(LOR)。由于此5种为同系物，有相同的骨架，拥有共同的特征峰，位于1163 cm-1，且浓度相同，对应的峰强度也不变。激光共聚焦拉曼光谱仪为利用EST的线性工作曲线来定量检测BZDs总含量提供了可行之处 (图4)。在此，准备了12个混合样品，包括两种、三种、四种或五种BZDs药物的混合，也有浓度差异。实验测试结果表明，BZDs药物的总浓度可以从EST的线性工作曲线直接获得，测试结果与总加标浓度具有很好的吻合度。将BZDs混合样注射到小鼠体内，随小鼠代谢采集不同时间的小鼠血清，发现血清中BZDs药物总量随小鼠代谢过程在开始阶段迅速增加，12 h达到最大值，此后逐渐降低。这一变化趋势与LC-MS/MS检测结果一致，说明该基底及其SERS检测方法对于定量检测BZDs药物是可靠且高效的。
图4：快速检测BZDs总含量。

综上，该工作开发了一种SERS定量分析方法，仅利用一种BZD药物作为标准品即可定量测定法医和生物医学环境中BZDs药物总量，从而可针对族类药物总量快速、灵敏的筛查。这是通过在大尺寸(111)晶面Ag纳米片上修饰少量ZnO为SERS活性基底来实现的，其既结合Ag(111)晶面取向优势又实现了CT增强效应，表现出优异的SERS活性和稳定性。该基底成功应用于血清和尿样中EST浓度的高灵敏度和高选择性SERS检测。并进一步应用于5种BZDs药物总浓度的检测，特别是成功监测了随小鼠代谢过程中小鼠血清中BZDs药物总量的变化趋势。该研究工作瞄准族类药物的靶向筛查模型，可作为急诊诊断和法医鉴定极具价值的分析工具。

该研究工作发表于Anal. Chem. 2021, 93, 3403-3410；入选Anal. Chem.第93卷第7期封面文章。

文章信息
这一成果以“Group-Targeting SERS Screening of Total Benzodiazepines Based on Large-Size (111) Faceted Silver Nanosheets Decorated with Zinc Oxide Nanoparticles”为题发表在Analytical chemistry上。兰州大学叶为春教授为论文通讯作者。
文章链接https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04399

本研究采用的是北京卓立汉光仪器有限公司 “Finder Vista”激光显微共聚焦拉曼光谱仪系统，如需了解该产品，欢迎咨询我司。
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