使用 Molecular Devices 新发布的 SoftMax Pro 7 软件进行平行线分析和相对活性评价

介绍
在生物实验中要经常要使用到的平行线分析 (PLA) 方法，当无法直接检测一个生物制品的活性而只能通过检测其产生的效果时， PLA方法通常会被用来进行效应曲线的比较来获得此制品的效果 (Figure1) 。如果对于两种物质其生物响应相似或者在两种不同的生物环境中同一种物质产生相似的效应曲线时，平行线分析法可以被用来进行评价。评价平行性是计算化合物或药物相对活性的前提，并且在很多生物应用中如药物活性比较、分析物鉴定、交叉反应、干扰物质、基质补偿、浓度估算和抑制效应等应用研究中。
当两条曲线被判定为平行时，其中一条曲线的函数可以通过通过另一条曲线的函数乘上一个比例系数向X轴的左边或右边变换获得： ƒ (x) = ƒ (rx)，其中 x 是剂量，r 是比例系数或相对活性。对于相对活性，一般将参考品 ( 已知品 ) 的活性设为 1，可以使用一个比例系数可以将参考品的曲线变换为测试品 ( 未知品 ) 曲线，那么这比例系数则被称之为测试品的相对活性。这个方法应用于线性拟合的曲线非常合适，因为线性拟合的曲线在整个浓度范围内的曲线斜率是保持一致的 (Figure2)。可是对于非线性拟合曲线如 4- 参数和 5- 参数曲线，S形的浓度效应曲线在整个测试浓度范围内具有变化的斜率值 (Figure1)。

用于评价平行性的方法根据平行性假设的验证方法不同大致可以分为两大类：效应比较法和参数比较法。本文将对这两大类方法进行详细解释和介绍怎样使用SoftMaxPro 7 软件进行平行性测试。我们建立了一个 Protocol 包括了使用 F- 检验进行 F- 检验概率测试和使用卡芳-检验进行卡芳概率测试。另外，对于参数比较法，根据菲勒定理我们也建立了一 个Parallelism Test 的 protocol 放在 SoftMaxPro Protocol 的库内。所有这些方法都可以被用于评价线性和非线性拟合曲线。

平行性检测
生物系统经常会出现不符合预期的现象，并且数据会出现一些噪声和波动；因此，选择正确的曲线拟合方式和权重因子，来消除这些噪声和波动是进行平行性评价前的首要一步。如果选择了一个不合适的拟合方式，那么可能在平行性评价系统内引入偏差，进而得出错误的结论。由于根据实际实验中的数据，很难获得完全平行的拟合曲线，尤其对于非线性拟合回归，而计算非平行曲线获得相对活性是很困难的。在效应比较法中，参考品和测试品的曲线会使用约束模型同时进行拟合，在这个模型中，曲线被强制变为平行；而在非约束模型中，两条曲线会各自进行拟合。通过统计学的方法，来比较约束模型和非约束模型两种拟合度的差异，这个差异可能是由于非平行性造成的。
在约束模型中，用来描述曲线的所有参数都是一样的，除了用来描述 X- 值的参数不一样；线性拟合中，X- 值是指截距，非线性拟合中是指上、下渐近线之间的中值，也就是 EC50 值。SoftMax Pro 软件具有计算线性拟合的相对活性，也可以使用约束性模型 ( 全局拟合模型 ) 和独立模型对非线性拟合曲线进行评价和计算相对活性。

• ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): 返回被拟合曲线的卡芳统计值
• ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): 返回被拟合曲线的卡芳统计值
概率分布值
• FStatPLA (PlotName@GraphSection):返回被拟合曲线的 F- 检验值
• FProbPLA (PlotName@GraphSection):返回被拟合曲线的 F- 检验值概率分布值
注：以上所有公式只有在曲线拟合选项置中的 Global Fit (PLA) 选项被使用的情况下才可以使用。PlotName@ GraphName 是曲线的全称，包含图表的名称，例如，Plot#1@Graph#1 或 Std@Standardcurve。指定某一条曲线作为公式内曲线是带有主观性的，实际上卡方值是从该图表中的所有曲线数据计算而来的。名称为“Parallel Line Analysis Using Ftest and Chi-squared Test”的模板，是根据这两种统计学方法而建立的 SMP 模板。当使用仪器直接获取到数据或者从外部导入数据到模板中后，所有的计算过程会自动进行，并进行零假设的评估，判断曲线是否平行。
在这个模板中， F- 检验和卡芳检验的概率值必须大于等于 0.05 才能认定曲线是平行的。一般来说，这个设置的意思是指有95% 的置信度该假设是成立的。置信程度是可以被调整的以适应不同实验的接受水平。

虚假设测试
在效应比较法中，平行性的计算通常是利用残差平方和 (RSSE) 的函数来进行的,以此来判断约束性模型对数据的拟合效果，另外一个特殊的方法，则是根据附加平方和的分析来进行。这个统计学回归方法是方差分析 (ANOVA) 的一种形式，其中虚假设的是约束性模型是正确的或者说曲线是相互平行的。虚假设的验证，可以使用各种不同的统计学技术，包括概率的 F- 检验或卡方检验。在这两种方法中，概率值会被计算出来，通常这个值介于 0-1 之间，当这个值接近 1 时，意味着曲线间的平行性在增大。需要注意的是，F- 检验是有一定缺陷的，此法对于对独立模型拟合度很高的曲线可能产生假阳性判断或者对于独立模型拟合度很低的曲线产生假阴性的判断。这两种方法都被收录进了 SoftMax Pro 软
件当中，检验值和概率值计算可以通过软件内的以下公式方便的获得：

噪声和权重
噪声是指检测响应的随机变化，当进行平行线评价时这是需要考虑的重要因素，因为它会影响检测平行性的能力。在高噪声的情况下，平行性计算值由于由于受噪声的影响过大，因此无法再正确地反应非平行性的程度。
对于 F- 检验和卡方检验法这两种方法，在计算各自的概率值的过程中对于不同噪声水平的处理能力是不同的。F- 检验的概率值不受此因素影响，但是卡芳检验概率计算值则高度依赖于噪声水平并要求对于数据方差进行准确的估算。因此，对于卡方检验法需要进行反方差权重设置。如在“Selecting the best weightingfactor in SoftMax Pro 7”此篇应用资料里讨论的，生物实验一般在在曲线的上半部分会有较大的方差。在无权重的回归分析中，平行性的结果会主要受曲线的上半部分的数据点影响，而曲线的下半部分的数据点在对于平行性结果的影响不大。在软件的模板中，权重因子的设置使用方差的倒数，但是根据情况可以调整为更合适的权重公式。另外，在 SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接进行方差的倒数权重项的设置 (Figure 4G)。卡方检验方法中，参数的置信区间设置项 (Figure 4H) 只有在‘Weights are Inverse Variances’项被选择的情况下才能使用。更合适的权重因子的设置会保证结果是主要来源于所有变化的数据点。

如何在SoftMax Pro使用PLA在 SoftMax Pro 7 软件中，PLA 可以在除了“point-to-point”,“log-logit”和“cubic spline”三种拟合方式之外的所有通用曲线拟合方式下使用。在图表部分，所有曲线具有一个共同的曲线拟合方程，PLA 的具体使用设置请见 Figure 4。
参数比较法
与响应比较法直接评价不同剂量曲线下的响应差异不同，参数比较法会各自独立地对非约束模型下的各个曲线的参数进行比较，并参考大概置信区间；参数对必须落在规定置信水平下的置信区间内。这种方法叫做等效测试和平行性小于规定阈值的测试法。欧洲药典中使用的斜率比值法就是等效测试法的一个例子。
菲勒定理
菲勒定理使用统计学方法计算两个参数比值的置信区间，使用 tInv 函数进行比值的计算，因此遵循带自由度的 t- 分布，其概率为 p。SoftMax Pro 软件的统计学公式，可以计算参考曲线和测试曲线各自曲线拟合参数之间比值的置信区间，并建立了一个模板 (Figure 5) 包含了这些计算和概率阈值设定 0.1 ( 90% 置信度 )，可做相应调整。为了判定参考曲线和测试曲线之间是否平行，需要将计算的置信区间与一定置信水平的固定置信区间进行比较；在此模板中，使用 90% 的置信水平，因此，计算的置信区间如果落在 0.9~1.1 之间，那么这两曲线将被认定为平行。

Figure 4. 如何在 SoftMax Pro 软件中应用 PLA 和进行相对活性计算。 选择一个包含多个曲线的图表，点击 home 栏图表工具中的曲线拟合设置项 (A)；或者在图表部分的上部的工具了项 (B)；在曲线拟合项对话框内选择 Global Fit (PLA) 项 (C)；在拟合下拉菜单内选择除 point-to-point, log-logit, 和cubic spline 三种拟合方式之外的任何拟合方式 (D)；选择一条曲线作为参考曲线 (E)；如有必要的话，选择相应的拟合参数和相对活性的置信区间 (F)；如有必要，选择相应的权重项，请参考“Selecting the best weighting factor in SoftMax Pro 7”中的关于如何在 SoftMax Pro V 版本 6.5 或更高版本中选择方差倒数作为权重因子的设置方法 (G)；如有必要，选择统计学工具按钮 (H)；当所有曲线选项设置好后，点击 OK 按钮，曲线会自动被拟合到约束型模型中，除了描述X轴的参数外，描述各条曲线的参数是相同的如 Figure 3. 对于非线性拟合函数，所有曲线的最小和最大响应值 ( 下平台和上平台值 )也被约束为相同的值。

对于线性拟合曲线，该测试会针对参考曲线和测试曲线的斜率值进行，也即 SoftMaxPro 软件中所描述的曲线方程内的 B 参数值。可是，对于非线性拟合曲线，此方法只测试上平台和斜率值，下平台则由于菲勒定理的数学局限而不做测试。在低浓度时，参数的变异会非常高，导致中间计算过程会产生虚数，进而导致最终计算的置信区间不正确或无法计
算。这个问题被美国农业部 (USDA) 的兽用生物制品中心建议将下平台值固定为 0，然后使用上平台和斜率值来进行测试。相同地，SoftMax Pro 软件的 Parallelism Test 的模板内，默认将下平台值设为 0，然后对斜率( 参数B ) 和作为上平台的参数 A 或 D 进行平行性结论的判断。

结论
众多的生物学实验都需要两条剂量效应曲线对的平行性进行判断，本应用文章介绍了如何使用 F- 检验和卡方检验的效应比较法以及费勒定理描述的参数比较法进行平行线分析。SoftMax Pro 7 软件中，可以选择使用约束性和非约束性曲线拟合模型以及高级的统计学公式计算分 析。同时SoftMax Pro 7 软件中，还提供预存的建立好的每种方法的模板供用户调用，轻松进行本来很复杂的平行线分析。