使用 SpectraMax Plus 384 微孔板读板机测量红酒中的酚类化合物

介绍
红酒中单宁，铁反应性酚类，花青素和聚合物色素的测定是葡萄酒行业质量控制的重要组成部分。准确、可靠地测量葡萄酒中的酚类化合物对于发酵，浸渍，压榨和混合过程中的决策至关重要。Harbertson等人于 2003 年开发了一种全面的红酒酚类测定法 (1)。传统上，该测定法是使用基于比色皿的紫外可见分光光度计进行的。读取单个比色皿中的单个样品，记录结果并分析数据是一个耗时且费力的过程 。Heredia 等人认为需要一种快速、经济有效的检测方法，因此将该检测方法应用于微孔板平台。这种方法增加了有关人工，时间和样品量的通量，扩大了中等规模酒厂中监测酚类化合物提取发酵过程的能力。在这里，我们描述了使用 MolecularDevices 公司的 SpectraMaxPlus 384 微孔板读板机和 SoftMaxPro 软件来有效收集和分析此测定的数据。SpectraMax Plus 384 微孔板读板机的一些独特功能包括：
• 波长范围：190‒1000 nm，以 1 nm 为增量
• 基于双单色器的光学元件使其无需使用滤光片 ( 图 1 )
• 读取速度：96 孔：5 秒384 孔：16 秒
• 温度：比环境温度高 4 °C 至 45 °C
• 比色皿插槽：可容纳标准比色皿和 12 x75 mm 试管
• OD 范围：0‒4 OD

红酒酚含量测定
Adams / Harbertson 测定法使用分光光度法、蛋白质沉淀法和亚硫酸氢盐漂白技术来测量红酒中的酚类。

PathCheck传感器
PathCheck 传感器是 可以测量微孔板中样品的光程。 这是将微孔板中的吸光度读数标准化为 1 厘米比色皿的创新方法。
Beer-Lambert定律指出吸光度 = E * C * L 其中
E = 吸收率 ( 消光系数 )
C = 浓度
L = 光程
在比色皿的情况下，光路是水平的。因此，光程是固定的，等于 1 cm。但是在微孔板的情况下，光路是垂直的。因此，光程长短取决于样品的体积 ( 图 2 )。 PathCheck传感器会纠正差异。
SoftMax Pro 软件
该软件控制仪器，收集数据并提供完整的数据分析。 带有适当的仪器设置和计算方法的客制化模板可以预先编写并保存。 最终用户可以方便地打开预先设置的模板，获得完整的结果和分析，而无需重新花费时间设置模板。

优势
• 与传统的比色皿方法相比，提高了通量
• 使用 SoftMax Pro 软件进行自动数据分析
• PathCheck 传感器用于微孔板孔中的吸光度读数的标准化

实验材料
• 葡萄酒样品: Pinot noir (Sonoma Coast)
• 马来酸(Fisher Scientific cat. #03417-500)
• 牛血清白蛋白 (Sigma cat. #A3803-10G)
• 三乙醇胺 (Sigma cat.#T1377-100 mL)
• Ferric chloride hexahydrate(Sigma cat.#236489-100G)
• (+)- 儿茶素 (Sigma cat. #C1251-5G)
• 乙酸 (Sigma cat. #242853-2.5KG)
• 氯化钠 (Fisher Scientific cat. #S271-3)
• 氢氧化钠(Fisher Scientific cat. #S318-500)
• 乙醇 (Acros cat. #61509-0040)
• 酒石酸氢钾 (Sigma cat. #243531- 500G)
仪器及配件
• SpectraMax Plus 384 微孔板读板机(Molecular Devices cat. #PLUS 384)
• 紫外可透 96 孔微孔板(Costar cat. #3635)
• 微量移液器(Drummond Scientific cat. #2704174,2705402, 2705412, 2704180; Drummond Digital Microdispenser cat.#3-000-510)
• 微量移液器的微量吸头(Eppendorf cat. #epT.I.P.S.; Reloadscat. #022491539, 022491512, 022491547)
• 微量离心管离心机(Eppendorf cat. #5424)
• 1.5 mL 微量离心管(Eppendorf cat. #022364111, 022363557,022363514, 2236357-3)
实验方法
儿茶素标准曲线
在微孔板中进行一系列稀释 ， 以 包 括0-300 mg/L 儿茶素，每个浓度两个复孔。用缓冲液 C 将最终体积调节至 262 µL。将板在振荡器上振荡，并向每个孔中加入38 µL 氯化铁溶液。将板进行震荡，进一步孵育 10 分钟，并在酶标仪中于 510 nm读取吸光度。 缓冲液 C 用作空白。