比较 FlexStation 3 读板机和 FLIPR Tetra 系统上的 Photina 发光法钙动员检测

简介
G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 是药物发现研究中最重要的治疗靶点之一。GPCRs 是膜定位蛋白，在细胞信号通路中起重要作用。当受体被配体激活时，受体的构象被改变，激活细胞内的 G 蛋白。活性 G 蛋白有可能诱导各种细胞内信使级联，包括钙离子。
钙激活发光蛋白是检测受体介导的哺乳动物细胞钙动员信号事件的重要工具。发光蛋白的一个主要优点是在钙离子与腔肠素 -发光蛋白复合物结合时立即发射闪光型发光。水母发光蛋白 (aequorin) 检测的背景信号接近于零，导致高的信号与背景比值。此外，腔肠素氧化发出的光不依赖于光学激发，从而消除了自发荧光的问题。现在有许多商业来源的发光 蛋白表达细胞系，使这项技术更容易获 得。这些测定方法在文献 1 中也有描述以及美国专利6,872,538 和欧洲专利 1,145,002。对专利方法感兴趣的用户可能希望在评估这些专利时咨询法律顾问。
Molecular Devices 公司的 FlexStation 3多功能微孔板读板机集成了移液系统，允许实时测量基于荧光和发光细胞的检测方法。可在复合添加之前、期间和之后同时监 测多达 8 ( 96 孔格式 ) 或 16 (384 孔格式 ) 孔。可通过用户定义的分液高度、化合物加液的速度、试剂源位置以及每次加液的吸头选择，很容易对检测进行优化。一次性移液吸头减少了加液和实验之间交叉污染的机会，并减少了孔板的死体积 ( 与注射器相比 )，节省了宝贵的试剂。
来 自 Molecular Devices 公 司 的 FLIPRTetra系统是市场上领先的监测 GPCR 和离子通道活性的仪器，并代表了一种可靠和灵活的 HTS/uHTS 解决方案， 用于在药物发现过程中早期鉴定前导化合物。
FLIPR Tetra 系统现在具有水母发光蛋白(aequorin) 选项可用，其中包括一种新的ICCD 相机技术，优化后可用于荧光和发光检测。此外，细胞悬浮系统使该系统能够以 96、384 和 1536 孔 格式进行贴壁和悬浮细胞检测。
本应用文献提供了一个基本方案，用于使用 FlexStation 3 读板机和带有 ICCD 像机的 FLIPR Tetra 系统执行贴壁的水母发光蛋白 (aequorin) 检 测。 这两种仪器都被用来测定在不同细胞浓 度下，CHO mitoPhotina/H3 细胞中 IMETIT 的浓度 - 响应。

优势
• 在药物发现过程中早期识别前导化合物的灵活的中、高通量解决方案
• FlexStation 3 读板机允许实时检测荧光和发光实验
• 具有水母发光蛋白 (aequorin)选项的 FLIPR Tetra 系统，包括一个 ICCD 像机，是为荧光和发光检测而优化的

材料和方法
• CHO mito-Photina/H3 细胞 (AxxamSpA)。H3 细胞系是通过稳定转染具有Ga16 和组胺 H3 基因的线粒体膜靶向嵌
合发光蛋白 photina 的 CHO-K1 细胞生成的。
• 培养基：含有 15 mM HEPES 的 Dulbecco′sMEM/ Nutrient Mix F12 培 养 基 (Cat.#11039-047), 并 加 入 1.35 mM 丙酮酸钠 (Cat. #11360-070), 10% FBS(Cat.#10082-147), 1% 青霉素 / 链霉素(Cat. #15070-063), 500 µg/mL 遗传霉素 (Cat. #10131-027) 和 1% L- 谷氨酰胺 (Cat.#25030-081), 以上均来自Invitrogen 公司。
• 无钙和镁离子的 PBS(Invitrogen Cat. #14190-144)
• 乙二胺四乙酸钠 (VERSENE)1:5000(Invitrogen Cat. #15040-066)
• 11 mM 天然腔肠素 (PharmaTech Int.Cat. # 55770-48-1) 储存液稀释于 DMSO(Sigma Cat.#D5879) 以及 1mM 谷胱甘肽(Sigma Cat.#G-6529)
• 检测缓冲液： 含 有 15 mM HEPES(Invitrogen Cat. #11039-047) 的无酚红DMEM/HAM ′ s F12 培养基 (Invitrogen
Cat. #11039-021) 并加有 0.1% BSA (SigmaCat. #A3294)
• 组胺 H3 激动剂：IMETIT(Sigma Cat. #I-135)
• 384 孔黑壁、底透微孔板(Corning Cat. #3712)
• 带有 ICCD 选项的 FLIPR Tetra 系统(Molecular Devices)
• FlexStation 3 多功能微孔板读板机(Molecular Devices)
方法
检测孔板准备
为了创 建检测孔板，用乙二胺四乙酸钠(VERSENE) 法收集 CHO mito-Photina/H3 细胞，在没有选择性抗生素的情况下重新悬浮于培养基中，并在 25 µL 体系中以不同的细胞浓度 (625、1250、2500 和5000 细 胞 / 孔 ) 接种在 384 孔 黑壁、 底透孔板中，在 37 ℃ 和 5% CO2 下 孵育过夜。

从培养箱中取出检测孔板，移去培养基，替换为含 5 µM 天然腔肠素的 25 µL 检测缓冲液。加入腔肠素的孔板室温下黑暗中孵育五分钟。
化合物板准备
用聚丙烯 384 孔 板在测定缓冲液中制备2X 浓 度 的 IMETIT，一 种 H3 组胺受体激动剂。
仪器设置和数据分析
腔肠素孵育之后， 检测孔板置于FlexStation 3 读板机或 FLIPR Tetra 系统。使用如表 1 参数的模板已在 SoftMaxPro 软件 (FlexStation 3) 中准备完毕，而使用表 2 参数的模板已在 ScreenWorks软件中 (FLIPR Tetra) 准备完毕。
发光读数为 15 秒为给出基线读数，然后使用仪器上的移液系统分配不同浓度的特定配体 (IMETIT)，同时监测发光的变化。平均 RLU( 最大 - 最小 )、标准偏差、EC50、EC80处的 Z 因子和浓度响应曲线图的均使用SoftMax Pro 软件计算得到。SoftMax Pro软件中已有针对 FlexStation 3 读板机的水母发光蛋白检测的预设模板。
结果
用闪光型发光法监测 mito-Photina/H3 转染的 CHO 细胞受到 IMETIT 刺激的钙流。在测定过程中，发光信号由
FlexStation 3 读 板 机 和 FLIPR Tetra 系统作为相 对发 光单位 (RLU) vs 时间来测量。根据 IMETIT 浓度绘制平均RLUs( 最大 - 最小 ) 以生成浓度 - 响应曲线 ( 图 1，FlexStation 3 读板机数据；图 2，FLIPRTetra 系统数据 ) 和计算的 EC50 值。IMETIT 的 EC50, EC80 的 Z 因子总结于表3 和 表 4。FlexStation 3 微孔板读板机上 的 IMETIT EC50 值范围从1.81 到 2.67nM， 而 在 带 有 ICCD 相 机 选 项 的 FLIPRTetra 系统上报道的 The EC50 值在 1.18到 3.00 nM 范围。两组结果均接近公布的EC50 值 3.43 nM。EC80 处 的 Z 因 子 在 两台仪器之间同样具有可比性。

总结
FlexStation 3 读板机和具有水母发光蛋白 (aequorin) 选项 ( ICCD 相机 ) 的 FLIPRTetra 系统已用于对 Photina 贴壁发 光细胞实验的测定。在使 用 FlexStation 3读板机或具有 ICCD 像机选项 的 FLIPRTetra 系统时，用于贴壁发光实验的Photina 细胞的制备和处理方法是相同的。这连同产生的数据的相关性，支持使用 FlexStation 3 读板机进行较低通量的Photina 检测。此外，该仪器还可用于开发易于转移到 FLIPR Tetra 系统以进行高通量筛选为目的的检测。