建立和优化荧光偏振测定法

目的
这篇技术说明是为了帮助用户建立最佳的荧光偏振检测方法，引导如何将现有的多种测定方法转换为可靠、灵敏的荧光偏振检测。在本文中，我们以常见的竞争性结合实验——受体和配体结合实验为例来说明这个问题。

设计 FP 受体 - 配体结合测定时应考虑的要点
1. 最大限度地增大示踪剂和受体之间的尺寸差异。 当使用常见的荧光染料如荧光素、Texas Red、Cy5、BODIPY 等，示踪剂的大小应小于 10kd，与肽相当，而受体大小应为 50kd 或者更大。通常认为，两者之间10 倍的分子量差异是比较好的。不过，如果不满足这些标准也可以尝试开展结合实验的评估，毕竟最初的FP 实验工作是使用白蛋白 (60 kD) 和抗体 (160 kD) 获得了可发表的结果。
2. 尽量减少其它检测材料对非特异性荧光偏振的影响。品质因素包括示踪剂的纯度，受体的纯度，缓冲液固有的荧光以及缓冲液组分如载体蛋白与示踪剂结合的能力。一些微孔板的材料如聚苯乙烯能够结合游离示踪剂，从而增加总极化，可使用非结合表面的微孔板来解决这个问题。
2a. 示踪剂应该大于 90% 的标记比率。 高百分比的未能标记的示踪剂意味着未标记的示踪剂将竞争受体，从而改变表观 IC50 ( 相互作用的表观亲和力，从而影响 IC50 的计算值 )。同样，无法从示踪剂中纯化出游离荧光基团意味着增加的总荧光部分将无法改变其偏振态。
2b. 使用高度提纯的受体。 由于大蛋白，细胞膜和细胞碎片会散射光，导致总极化净增加，因此应尽量减少这些杂质。适当的背景扣除可以对它们进行部分校正，但是zui好的方法是使用纯化的受体，这将对信号 ( 以及由此产生的噪声 ) 的影响降至最低。另外，受体制剂的反复冻融可能会导致聚集增加，从而降低其检测性能，采用窄口注射器进行破碎以及沉降 / 离心等方法来去除聚集物。
2c. 减少缓冲溶液对信号的影响。 缓冲液荧光本底的增加是由于污染物在目标波长下发出荧光，应将原材料，混合和储存容器的清洁度以及缓冲液的制备方法降至可接受的水平，因为缓冲液或非荧光团成分导致的高本底会严重影响 FP 测定的信噪比以及最终的检测灵敏度。
2d. 避免 BSA 干扰。 蛋白质缓冲液通常包括载体蛋白，例如牛血清白蛋白 (BSA)，白蛋白可能会结合某些荧光团，这可能会增加荧光基线值，缩小测定范围。解决方案包括避免使用载体蛋白或使用低结合的替代物，如牛丙种球蛋白(BGG)。在任何情况下，通过比较添加和不添加蛋白质的缓冲液中示踪剂的极化，来评估缓冲蛋白对示踪剂净极化的影响都是一个有效的方法。或者，通过降低BSA 的最终浓度来最小化这些影响。
3. 确定实验标准。应确定微孔板的类型，实验体积以及检测速度与检测灵敏度 / 精密度的相对重要性，zui好在接近最终实验条件的条件下进行可行性研究，测定可行性可以采用大于目标体积的实验体积。
4. 确定开发标准。 与 HTS 的单孔实验相比，FP 的实验方案开发和验证通常需要更多的重复和对照，评估标准包括试剂消耗量，读取时间，孵育时间和条件，信噪比 ( 见下文 )，精度，灵敏度和重现性等。

建立和优化 FP 受体 - 配体结合实验的步骤
1. 确定仪器的最佳参数设置。 如果使用 MolecularDevices 公司的多功能酶标仪进行 FP 结合实验的测定，我们建议优化以下参数：PMT 设置、Z 轴高度、积分时间或者每孔闪烁次数。
2. 确定游离示踪剂的最佳浓度。 此步骤通过检查产生的信号和偏振的浓度独立性来确定示踪剂浓度的可接受范围。选择使用可提供良好信噪比的最低示踪剂浓度 , 另外，还有一些生化方面的考虑，示踪剂的浓度应小于 Kd ( 如果已知 )，并且应小于受体的浓度。比较游离示踪剂与游离荧光团的 mP 值 ( 同时检测游离荧光团 ) 可确定示踪剂大小的适用性。 如果示踪剂的 mP显著大于游离荧光团的 mP，说明示踪剂可能太大而无法用于 FP。
2a. 使用 4 个或更多重复样本对游离示踪剂进行连续稀释 ( 例如，从 100 nM 到 0.1 nM )。
2b. 在研究示踪剂的同时，评估游离荧光团， 对游离荧光团 ( 如用于标记示踪剂的荧光团 ) 以 4 个或更多的重复进行连续稀释 ( 例如从 100 nM 到 0.1nM )。每个浓度至少应重复 4 个点，以便随后对背景“ 噪声 ”水平进行统计评估。
2c. 实验体系中应包含仅是缓冲液的空白对照，以便进行背景扣除。计算空白对照的垂直偏振 S 平均值和水平偏振 P 平均值，然后从包含示踪剂和游离荧光团的孔的各个 S 和 P 值中减去空白对照平均值，完成背景扣除。
2d. 使 用文献中荧光染料 的理 论 mP ( 如荧光素和Texas Red 为 27 ) 以及合适浓度下游离荧光团的偏振值计算得出 G 因子，当游离荧光团的 S 和 P值均远高于背景值 ( 缓冲液空白对照值 ) 的时候，该浓度被认定是合适的。G 因子的计算公式为：G= S/P *[(1-27/1000)/(1+27/1000)]，其中游离荧光团的 S 和 P 值是已经扣除背景之后的数值。
2e. 游离示踪剂荧光偏振值 mP 的计算公式为：mP=[(S - P*G)/(S + P*G)]*100，使用步骤 2d 中计算得到的 G 因子，S 和 P 值同样是扣除背景之后的数值。作为对照，游离荧光团的 mP 值应接近于理论值。理想情况下，示踪剂的值应接近游离荧光团的值，这表明配体的大小和旋转速度受荧光团的缀合影响很大。如果该值大得多，则表明示踪剂可能足够大，足以降低与受体结合时的有效偏振变化。示踪剂的可接受浓度范围包括偏振值 (mP) 接近规定的 27 mP 的所有浓度。示踪剂的原始信号值应至少是缓冲液空白信号的 3 倍。
以荧光强度 (FI) 模式重新读板可评估游离示踪剂的淬灭程度， 淬灭效应会影响基于荧光强度测量的最终检测灵敏度。比较游离溶液中荧光团标记的分子与荧光团本身的摩尔荧光强度，确定化学偶联过程本身造成的淬灭程度，例如，如果没有淬灭，1nm 荧光肽的信号应该与 1nm 荧光素钠的信号相同。如果另一分子偶联的荧光素比游离荧光素具有更高的荧光信号，这可能表明我们选择了不合适的示踪剂浓度。同样，如果示踪剂的信号少于相同浓度的游离标记物信号的 20％，那么它很有可能是被高度淬灭了，这可能是由示踪剂过低的标记百分率，不合适的浓度或者更多组合因素造成的。
值得注意的是，荧光偏振往往会导致荧光强度损失约 10–90％，相对于直接的荧光强度测量，这本身可能会降低荧光偏振的灵敏度。
3. 使用适当的参照条件滴定受体。 此步骤的目的是确定受体和示踪剂的最佳浓度。使用适当的参照条件可以精确估计特定的偏振。在存在示踪剂和不存在示踪剂的两种条件下，测试多种浓度的受体 (“ 蛋白质 ”)。由于受体可能会产生净信号，所以不存在示踪剂的受体可以作为一个参照。 对于多种浓度的受体，每种受体均应设置仅是缓冲液的空白参照。受体的浓度应该高于示踪剂的浓度。最初可以尝试多种浓度的示踪剂，其浓度应该在 Kd 以下，初次实验可能使用的示踪
剂和受体的浓度范围比较宽泛，而后续实验可以只使用固定浓度的示踪剂和一系列紧凑有限稀释的受体。从 4X Kd 滴定受体，从 1X Kd 滴定示踪剂是一个不错的开始。对于早期实验，至少进行三次重复 ; 增加重复的数量可以更准确地估计测定的不精确性。为了能够准确确定实验的不精确性，每个实验条件应至少重复三次。具体的参照组包括：
3a. 缓冲 液空白对照：表示缓冲液对 S 和 P 信号的影响，特别是当缓冲液中存在干扰分子时 ( 如蔗糖 )。它被用作仅有示踪剂的对照孔信号的背景扣除。
3b. 示踪剂对 照：背景 扣除后 的 S 和 P 值用于 G 因子计算，计算公式：G = S / P * [(1-27 / 1000)/(1 +27/1000)]，其中 S 和 P 值是游离示踪剂的 S 和 P值减去了缓冲液空白对照的 S 和 P 值。G 因子应该是一个非常稳定的值，并且在之前计算出的值应该是合适的，不过此时有必要对 G 因子进行早期估算。
值得注意的是，信号/噪声的代表值可以从示踪剂对照的 S 值计算出来，理论上，示踪剂对照的信号至少是缓冲液空白对照信号的 10 倍。
3c. 蛋白质对照：表示特定蛋白受体对光散射的影响，尤其是膜结合受体。它被用作 [ 蛋白质 + 示踪剂 ]对照孔信号的背景扣除。因为要使用几种浓度的蛋白质，所以每一种浓度都应在没有示踪剂的情况
下进行测试，计算出的平均 S 和 P 值被各个孔的 S和 P 值减去以获得 mP。
3d. [ 蛋白质 + 示踪剂 ] 对照：确定 mP 的最大值。根据蛋白质的滴定与示踪剂的滴定来确定蛋白质和示踪剂的最佳浓度，这是荧光偏振测定的关键内容。如上所述，从 4X Kd 滴定蛋白质，从 1X Kd 滴定示踪剂是一个良好的开始。
如果受体的浓度是 Kd，并且示踪剂的浓度小于受体，那么受体应绑定一半浓度的示踪剂。蛋白质 +示踪剂对照孔的 S 和 P 值要减去蛋白质对照孔的信号值。对于背景扣除，计算蛋白质对照孔的 S 和P 值的平均值，然后用含示踪剂、蛋白质和化合物/ 对照孔的各个 S 和 P 值减去适当的均值。采用从步骤 2b 中计算出的 G 因子。
3e. 有三个参数可以评估：减去背景的 mP 值，测定的不精确度和极化变化。不精确度是每组 mP 值均值的标准偏差，通常应小于 10 mP。极化变化时的测定范围由 [ 蛋白质 + 示踪剂 ] 对照的平均 mP 减去游离示踪剂的平均 mP 计算得出。应存在一个平台效应，即超过最佳的受体浓度不会使 mP 进一步增加。受体浓度的不精确度小于 10mp，且mP 的最大变化能提供最大的测定范围。不过，受体浓度略低于平台期可以提供更好的性能，并消耗更少的贵重试剂。 理想情况下，极化的净变化应大于 70 mP。
4. 一种或多种测定方案中的效价竞争分子。 竞争分子可能是未标记的示踪剂或已知抑制示踪剂与受体结合的其它分子。示踪剂和受体的浓度以步骤 3 中确定的浓度为准，可以大大提高 mP；现在添加竞争分子会使极化返回到自由示踪剂的极化。使用竞争分子的 2 倍，
3 倍或 5 倍的稀释系列，并将稀释的浓度值转换成对数以获得最具描述性的结果，这应该是一个 S 型抑制曲线，可给出极化净减少 50％ 的中点是 IC50 ( IC 表示抑制浓度 )，这些值可以与科学文献中发表的值进行比较，或通过实验室中的其他方法获得，同时需要评估不精确度和极化的净变化。
5. 分析鉴定。 到这一步，我们要考虑实验中试剂添加步骤的数量以及将示踪剂和受体结合为单一试剂的可能性。并且，竞争分子如校准品，阳性对照和阴性对照的体积和缓冲液应该与化合物的保持一致，例如，如果要在含 10％ DMSO 的缓冲液中加入化合物，则竞争分子也应采用这种条件，包括其他对照组，以评估系统对溶剂 (DMSO)，孵育时间和温度以及试剂储存稳定性的敏感性。在此阶段还可以评估其他性能标准。
6. 讨论。 如果不精确度或净极化变化不可接受，应采取措施评估不精确度的来源。不精确度的可能来源，如移液，仪器，缓冲液，示踪剂，蛋白质等，每个组成部分都会导致结果的不精确。不精确性的主要 ( 最大 )来源应该是提高测定性能，这是最有价值的方面。对于净极化变化不足的情况，可评估其它示踪剂或受体( 如果有 )。200 - 300mp ( 或更高 ) 的最大偏振值是不常见的。许多因素会导致降低理论上可获得的最大极化值，这些影响因素可能是分子自身对荧光团的淬灭，缓冲液淬灭，表面吸附，旋转自旋 (“ 螺旋桨效应 ”)以及组分之间相互作用的亲和力低。可获得的最大理论 mP 值为 500 mP，因此，任何大于此值的实验值都表明测定中存在假阳性，出现这种情况，应排查对照。有时，某些成分会产生较大的背景强度值，如果控制不当，则会掩盖偏振效应。作为对系统的另一项检查，建议以荧光强度模式重新读取实验板。 如果每个孔中存在相同数量的示踪剂，则在荧光强度模式下，整个板上的强度值应相等。然而，如果某些样品条件本身 ( 如与蛋白质结合 ) 对荧光有任何特殊的淬灭或增强其效果，或试剂添加步骤的不精确性，这些可以通过强度测量的变化来确定。
注意事项
• 控制外部极化。 对于不是由感兴趣的生化结合事件引起的偏振变化，有两种方法可以控制。外部偏振的一种来源是仪器光路中的光学元件，这可由 G 因子进行校正；不相关极化的第二个来源是缓冲液造成的，这可由背景扣除法来去除。
• 最小 mP。 偏振值 (mP) 表示荧光分子的分子翻滚速率，它与在恒定温度和黏度下的分子大小和分子形状有关。例如，3 kD 的分子的偏振值可能为 30 mP，而 5kD 的分子的偏振值可能为 60 mP。对于刚性球形荧光素示踪剂，mP 在其分子大小约 10 kD 时达到最大值，最大值为 500 mP。
• 最大 mP。 当一个小的游离示踪剂与大分子结合时，预计 mP 会增加。 一个好的 FP 分析通常 mP 值变化为100 或者更大。
• 数据分析。 分析性能可以由多种方法来进行评估和表达。在描述基于 FP 的受体结合分析的性能时，两个参数特别有价值：第一个参数是加入受体后偏振值的净增加。 这可以通过从 [ 示踪剂 + 受体 ] 组中减去游离示踪剂的 mP 来算出，这是上文中提到的 mP 变化 ; 第二个参数是测量的不精确度，这是信号的标准偏差，单位为 mP。由于这些 FP 分析中的所有实验组均包含相同数量的荧光，因此预期的信号和该信号的标准偏差应与化合物，蛋白质或对照的量或作用无关。组合这两个参数的一种有用方法类似于信噪比，其中净 ( 或“ 增量 ”) mP 对应于信号，而不精确度 ( 标准偏差 ) 则对
应于“ 噪声 ”。
• 试剂。 如果你缺少 FP 实验的试剂，有许多可商购的试剂盒用于结合测定。