用 cAMP-Gs HiRange HTRF 法检测 GPCR 活性

介绍
HTRF 是由 Cisbio 开发的用于检测生物分子相互作用的通用技术。它将荧光共振能量转移 (FRET) 技术与荧光的时间分辨(TR) 测量相结合，可以消除短寿命的背景荧光。该测定使用供体和受体荧光团，它们用于标记要研究其结合的蛋白质或其他生物分子。 当两个生物分子相互结合时，供体和受体就靠在一起了。能量源 ( 例如闪光灯 ) 对供体的激发触发能量转移到受体，受体继而在给定波长发射特定荧光。
HTRF 使用四种特定的荧光团，它们可以组合形成相容的供体 - 受体 TR-FRET 对。 供体是穴状铕 (Eu3+) 和铽穴状化合物(Lumi4 ™ -Tb)，它们的长寿命荧光使其可用于时间分辨荧光分析。已经开发了两种受体用于 HTRF 分析，XL665 和 d2。两者的激发光谱都与 HTRF 供体的发射光谱重叠，在 665 nm处的发射峰落在供体不显著发射的区域内。最初的 HTRF 受体 XL665 是一种从红藻中纯化的藻胆蛋白色素。 第二代受体d2 是改良的别藻蓝蛋白，比 XL665 小 100 倍，旨在缓解基于XL665 的检测可能出现的空间位阻问题。

HTRF cAMP HiRange 试剂盒对细胞样品中的环腺苷 酸(cAMP，cyclic adenosine 3’, 5’–monophosphate) 进行定量。 cAMP 是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 信号传导中的关键第二信使。配体与 GPCR 结合后，会发生构象变化，激活受体，进而激活 G 蛋白。 进一步的信号转导取决于激活的 G 蛋白的类型。 Gs 蛋白的活化导致腺苷酸环化酶对 cAMP 的上调。细胞产生的游离 cAMP 与 d2 标记的 cAMP 竞争结合抗 cAMP穴状化合物，因此细胞 cAMP 的增加导致 FRET 的减少，这可以通过 665 nm 发射的荧光减少来检测 ( 图 1 )。

优势
• 拥有 HTRF 兼容性认证，确保仪器性能
• 高度稳定、均质的高通量检测
• 使用预设的 SoftMax Pro 软件方法更快地获得结果

在这里，我们展示了如何用 SpectraMax® i3x 和 SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机 ( 均通过 Cisbio 的 HTRF 兼容性认证 ) 对 GPCR 活性进行稳健、免洗的检测。

材料
• cAMP Gs HiRange 试剂盒( 1000 次测试，Cisbio cat.#62AM6PEB )
• 白色低体积 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
• SpectraMax i3x 多 功 能 微 孔 板 读 板 机 (Molecular Devicescat. #i3x)
• SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机 (Molecular Devicescat. #iD5)
• 用于 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机的 HTRF 检测卡盒(Molecular Devices cat. #0200-7011)
• 用于 SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机的 HTRF 检测系统( Molecular Devices cat. #6590-0144，包括增强型 TRF 模块和 HTRF 滤片 )
方法
cAMP Gs HiRange 试剂盒由 Cisbio 提供。 如试剂盒包装插页所示，制备终浓度范围为 0.17 nM 至 2800 nM 的cAMP 标准品。包括不含 cAMP( 最大 FRET ) 的阳性对照和不含 cAMP或 cAMP-d2 的阴性对照。 将试剂分配至低体积 384 孔微孔板中，每孔终体积 20 µL，如表 1 所示。

将孔板在室温下加盖孵育一小时。 时间分辨荧光在SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 微孔板读板机上使用SoftMax Pro 软件中的预设方法进行测量 ( 有关仪器特定设置，请参见表 2 和表 3 )。在 SpectraMax i3x 和 SpectraMaxiD5 读板机上进行了微孔板优化和读取高度调整，以确保最佳的检测灵敏度和动态范围。
数据分析
基于检测到的两个发射波长，HTRF 实验使用 Cisbio 专利的比值算法进行分析，分析步骤如下所示。 供体在 616 nm 的发射用作内参，受体在 665 nm 的发射用作所测定生物反应的指示。 这种比率测量减少了孔与孔之间的差异并消除了化合物干扰。 Delta F，在下面的步骤 4 中计算，反映了检测的信噪比，可用于内部测定的比较。 结果由 665 nm/616 nm 比率计算得出，并以 Delta F 表示如下：

使用 SoftMax Pro 软件生成和分析数据，该软件包含多个预设的 HTRF 方法，其中包含上述步骤以简化检测和分析。
实验结果
数据如上所述进行分析，并使用 SoftMax Pro 软件使用 4 参数曲线拟合绘制图表 ( 图 2 )。使用表 2 ( SpectraMax i3x 读板机 ) 或表 3 ( SpectraMax iD5 读板机 ) 中指示的读板机设置获得了最佳结果。这些设置是与 Cisbio 合作优化的，以证明读板机与 HTRF 兼容。 更改延迟时间、检测时间或脉冲数可能会导致不太理想的结果。
Cisbio 指出，使用 EC50 和信噪比来评估方法的适用性，二者应分别 ≤ 25 nM 和 ≥ 20。两种读板机的 EC50 值都非常相似，并且在可接受的范围内 ( 表 4 )。SpectraMax iD5 读板机的信噪比略有提高，但两种读板机的信噪比均高于可接受的限值，CV 值 低 于 6%。SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5读板机都为 cAMP Gs HiRange 检测提供了高灵敏度和宽的动态范围。

结论
SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 读板机可配备 HTRF 认证的检测卡盒 (i3x) 或 HTRF 认证的模块和滤片 (iD5)，以满足 HTRF检测所要求的苛刻参数。 两种读板机都证明了他们进行 cAMP Gs HiRange 检测的能力，结果完全在 Cisbio 要求的范围内。 数据采集和分析可以通过使用带有预设 HTRF 方法的 SoftMax Pro 软件来进行简化。