在 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机上开发优化的工作流程进行钙流检测分析

简介
由于实验室的需求经常会随着研究的需要而变化，因此拥有一台多功能微孔板读板机 ( 具备光吸收、发光和荧光等多种检测模式 ) 已成为必需。拥有一个易于升级的读板机是非常重要的，例如，提供一个分配选项以方便进行基于细胞的分析测定，而不必购买多个专用仪器，可以在确保灵活性的同时，节省成本并减少占用工作台空间。对从生物化学到基于细胞的检测感兴趣的研究人员通常希望从每个微孔板中提取尽可能多的信息，最常见的例子是 GPCR介导的钙信号的动力学检测和离子通道活性检测。通常，在这些分析中，信号会在几秒钟内达到最大值并衰减，因此必须在化合物注入的同时进行实时监测。
在这里，我们展示了使用配备双注射器系统的 SpectraMax iD3 和 iD5 多功能微孔 板读 板机开发信息丰富、基于荧 光的分析方法，以监测细胞内钙离子的变化。此外，使用免洗FLIPR 钙 6 和 6-QF 检测试剂盒可以增强检测信号窗口，提高检测的稳健性，并提供必要的灵活性，适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

我们利用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板读板机开发了两种检测方法，并与工业标准 FlexStation3 多功能微孔板读板机上运行的相同检测方法进行了比较。首先，我们利用 FLIPR 钙 6试剂盒建立了一种贴壁细胞的分析方法，以研究 1321N1 人星形细胞瘤细胞系中的毒蕈碱乙酰胆碱受体。然后，我们使用THP-1 细胞 ( 一种人单核细胞悬浮细胞系 )，开发了一个简单的工作流程，以便能够使 用 FLIPR 钙 6-QF 检测试剂盒分析研究嘌呤能 P2Y 受体。

优势

• 经过优化和验证的试剂可实现简单，可靠且可重复的检测方案
• 多功能微孔板读板机可以满足您不断变化的实验室需求
• SoftMax Pro 软件支持自定义分析工作流程，以简化数据采集和分析流程

材料
试剂
• 1321N1 细胞 (ECACC cat. #86030402)
• 培养基：DMEM + 2mM 谷氨酰胺 + 10％胎牛血清 (FBS)
• THP 1 细胞 (ECACC cat. #88081201)
• 培养基：RPMI 1640 + 2mM 谷氨酰胺 +10％胎牛血清 (FBS)
• Hanks’平衡盐溶液 (HBSS), 含钙和镁 (Sigma-Aldrich cat.#55037C)
• 氨基甲酰胆碱氯化物 (Sigma-Aldrich cat. #C4382)
• 乙酰胆碱氯化物 (Sigma-Aldrich cat. #A6625)
• 阿托品 (Sigma-Aldrich cat. #A0132)
• 盐酸哌仑西平 (Sigma-Aldrich cat. # P7412)
• 腺苷 5'- 三磷酸 (ATP) 二钠盐 (Sigma-Aldrich cat. #A2383)
• 尿 苷 5'- 三 磷 酸 (UTP) 二 钠 盐 (UTP)disodium salt(Sigmacat. #U6625)
• 丙磺舒 (AAT Bioquest cat. # 20061)
• FLIPR 钙 6 检测试剂盒 (Molecular Devices cat. #R8190)
• FLIPR 6-QF 钙检测试剂盒 (Molecular Devices cat. #R8192)仪器
• SpectraMaxiD3 和 iD5 多 功 能 微 孔 板 读 板 机 (Molecular Devices)
• SpectraMax 注射器 (Molecular Devices cat. #0200-7029)
• FlexStation 3 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices)
• 8 通道移液器头配件 (Molecular Devices cat. #0200-6182)

微孔板
• CellBIND 黑色底透无菌 96 孔微孔板 (Corning cat. #3340)
• Greiner 透明圆底未灭菌 96 孔微孔板 (Greiner cat. #650201)
方法
细胞制备
将“ 准备实验 ”的冷冻细胞 1321N1 迅速解冻，以每孔 2 x 104密度将细胞接种到加入 200 µL DMEM 培养基的黑色底透 96孔微孔板中。将细胞在 37℃，95% 湿度和 5% CO2 的条件下孵育过夜。
在添加 RPMI 的培养基中悬浮培养 THP-1 细胞，培养条件为37℃，95% 湿度和 5% CO2。在实验当天，将每次测定所需的细胞等分到 50 mL 离心管中，并以 1,000 rpm 离心 5 分钟。
染料负载
对于 1321N1 细胞，除去培养基，每孔加入 200 µL FLIPR 钙6 试剂 ( 含丙磺舒 )。 将培养皿在 37℃，5% CO2 条件下孵育 1小时 45 分钟，然后在室温下孵育 15 分钟。对于 THP 1 细胞，离心后将细胞以 1.25 x 106 细胞 / mL 的浓度重悬于 FLIPR 钙 6-QF 试剂 ( 含丙磺舒 ) 中。钙 6-QF 不使用屏蔽染料技术，非常适合分析不在孔底部单层，而是真正悬浮的细胞 ( 图 1 )。将细胞在 37℃ 的水浴中振荡孵育 2 小时，检测前 2 分钟将 180 µL 的细胞悬液分配到微孔板每个孔中。

检测方案
使用配备 SpectraMax 注射器卡盒的 SpectraMax iD3 或iD5 读板机获得激动剂浓度 - 反应曲线，每次获得一种激动剂
浓度。从低浓度到高浓度对每条浓度 - 反应曲线进行分析测定，以减少残留。用化合物灌注注射器，然后将装有染料的
细胞板置于仪器中，每个浓度使用 3 个复孔进行测定。对于1321N1 细胞，使用 SmartInject ™ 技术将 50 µL 5X 浓缩化合物注入每个孔中，注入过程中摇匀微孔板以确保试剂混合。设置参见图 2。

对于 THP-1 细胞，将 180 µL 的 FLIPR 钙 6-QF 试剂移入微孔板的三个孔中，然后使用与 1321N1 细胞的化合物添加类似的方案，但使用较小体积的 20 µL 的 10X 激动剂添加，以减少注射伪影。然后将化合物从注射器管路中移除，并用下一个最高浓度的化合物灌注注射器。创建一个新的微孔板设置，并在下一组三个复孔上进行检测 ( 图 3 )。
对每个化合物浓度重复该过程。使用 SoftMax Pro 7.1 软件中的实验流程编辑器 (Acquisition Plan Editor) 进行仪器和注射器的设置 ( 图 2 )。对于拮抗剂研究 ( 仅 1321N1 细胞 )，移除细胞培养基，并用每孔 180 μL FLIPR 钙 6 测定试剂代替。将细胞在 37℃ 孵育105 分钟，加入 20 µL 10X 浓缩拮抗剂，在室温下平衡 15 分钟。然后使用注射器 1 或注射器 2 以预先确定的 EC80 浓度，一式三份地添加体积为 50 µL 的激动剂 ( 5X 浓度 )。

图 2 使用 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机测定 1321N1 细胞中钙离子的实验流程设置。 SoftMax Pro 7.1 ( 及更高版本 ) 软件中的实验流程编辑器(Acquisition Plan Editor) 提供一个图形化的拖放界面，便于进行分析设置。

图 3 SoftMax Pro 7.1 软件中的导航树显示在 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机上对 7 点浓度的卡巴醇处理 1321N1 细胞的浓度 - 反应曲线的微孔板设置。 针对不同浓度创建不同的微孔板设置区域。
在 FlexStation 3 读板机上使用类似染料加载和拮抗剂孵育的方案，但是使用了集成的 8 通道移液器将 7 种浓度的激动剂和缓冲液对照同时从化合物板传送到细胞板的每个孔。或使用 8 个重复的 EC80 浓度的激动剂用于拮抗剂研究。
结果
使用配备双注射器的 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板读板机，我们在贴壁和悬浮细胞系中均获得了稳健的激动剂和拮抗剂浓度 - 反应曲线。使用 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机获得的贴壁细胞 1321N1 的动力学数据，与在中通量 FlexStation 3读板机和 FLIPR®Penta 高通量细胞筛选系统上获得的动力学数据一致，在这三个系统上均达到类似的最大响应 ( 图 4 )。使用悬浮细胞 THP-1 时也得到类似的实验结果 ( 图 6 )。对于贴壁细胞 1321N1，我们使用具有新型屏蔽技术的 FLIPR钙 6 试剂来减少细胞外的背景。我 们 检 测了细胞对毒蕈碱受体配体乙酰胆碱、卡巴胆碱、阿托品和哌仑西平的反应。
SoftMax Pro 软件内置的 4 参数曲线拟合和自定义数据运算可用于计算激动剂 EC50 值以及拮抗剂 IC50 值 ( 图 5 )。表 1 显示了使用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板读板机计算获得的 EC50 和 IC50 值， 以 及 在 FlexStation 3 读板机和
FLIPR Penta 系统上获得的等效数据。使用三种仪器获得的实验数据之间均未观察到显著差异。

图 4 使用 iD5 读板机 (A)、FlexStation 3 读板机 (B) 和 FLIPR Penta 系统 (C) 检测 FLIPR 钙 6 试剂装载的 1321N1 细胞对乙酰胆碱的浓度响应的动力学曲线。

对于悬浮细胞，之前我们通常使用传统方法在微孔板底部形成单层载染细胞，然后轻轻地添加配体来启动钙离子反应，以避免对细胞层产生不利影响。为了节省分析准备时间和细胞培养耗材，兼顾生成稳定可靠的信号，我们开发了一个基于使用钙 6-QF 选项的工作流程。这使我们能够在不受淬灭剂干扰的情况下保持细胞悬浮状态，并且我们调整了实验体积以尽量减少干扰，提供一个良好的信号窗口 ( 图 6 )。使用 4 参数曲线拟合来计算激动剂的 EC50 值 ( 图 7 )。
使 用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板读板机计算出的 UTP和 ATP 的 EC50， 以 及 通 过 FlexStation 3 微孔板读板机 和FLIPR Penta 系统获得的等效数据如表 2 所示。使用三种仪器获得的实验数据之间均未观察到显著差异。

表 2 从钙 6-QF 染料负载的 THP-1 细胞中获得的激动剂 EC50 值。 所有数据均以 µM 为单位，且 n ≥ 3 个独立实验。
总结
我们的实验结果表明，将带有 SmartInject 技术 SpectraMax 注射器卡盒的 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机，与 FLIPR 钙 6 和6-QF 检测试剂盒共同使用，在贴壁细胞系和悬浮细胞系中开发可靠和可重复的动力学分析检测方法是可行的。
对于使用屏蔽技术的 FLIPR 钙 6 试剂负载的贴壁细胞 1321N1，使用 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机得到的激动剂和拮抗剂的数据与中通量和高通量系统 ( 如 FlexStation 3 读板机和 FLIPR Penta 系统 ) 得到的数据是一致的。此外，对于 THP-1 细胞，我们首次展示了在 iD3 和 iD5 读板机上开发新的工作流程，使得在开发细胞内 Ca2+ 分析时使用悬浮细胞成为可能。此外，在 SpectraMax iD3 和 iD5 读板机上获得的数据与在 FlexStation 3 读板机和 FLIPR Penta 系统上获得的数据具有很好的相关性。这些多功能读板机价格合理且系统可升级，到手后研究人员可以立即进行 ELISA 和细胞活力测定。只需添加注射器模块，即可开发信息丰富、基于细胞的动力学分析方法，分析方法可与在高通量系统上开发的方法相媲美。