应用文集 | 聚集体分析「柱」力提高生物制药关键质量属性

众所周知，蛋白质通常容易由于环境条件刺激而发生聚集，形成二聚体和大分子量低聚物或高阶结构。这在生物治 疗蛋白质的生产中尤为重要，因为目标蛋白质需要承受的多种环境条件都可能诱导聚集。这些条件包括发酵过程中温度和浓度的变化，以及下游处理过程中 pH 和浓度的变化。甚至剪切力（来自叶轮叶片、搅拌器和其他工程设备）也可能导致应激相关聚集。聚集体，特别是分子量非常大的多聚体以至不溶性微粒的存在，都可能会对健康有害。因此，必须量化和确定聚集水平，并予以限制。

体积排阻色谱是特别适合从高阶聚集体中分离单体峰的技术之一。使用合适的浓度检测器，例如 UV 或 DAD，可以相对直观地进行定量。抗体药物偶联物（ADC）等更为复杂的分子可能更具挑战性，因为疏水性细胞毒性药物的存在可能导致许多体积排阻色谱柱无法发挥理想性能。为解决这一问题，安捷伦开发了一种新的固定相，可显著降低次级相互作用的风险。因此，新型 AdvanceBio SEC 色谱柱非常适合聚合物的快速分离和定量。

本应用文集分别从入门指南篇、体积排阻色谱操作指南篇、精选应用简报篇分类介绍创新的 AdvanceBio SEC 色谱柱如何精 准定量分析蛋白质聚集体研究的完整工作流程及应用案例，进而“柱”力提高生物药行业关键质量属性。准备好了吗？系好您的安全带，立刻启航！

体积排阻色谱操作指南篇

适合各种生物分子分离的准确定量分析

利用生物分子在溶液中的体积而进行色谱分离的方法即为体积排阻色谱 (SEC)。与其他色谱模式不同，SEC 的分离不依靠分析物和色谱柱固定相之间的任何化学作用。这是从多种干扰物（包括聚集体、辅料、细胞碎片及其他降解产生的杂质）中分离和分析完整蛋白质的理想解决方案。因此，SEC 广泛应用于开发和生产过程中的生物治 疗性分子表征。

 优势如下   

SEC 分析方法简单直接   

利用 SEC，分子可按其在溶液中的尺寸为参照，做到从大到小依次分离。非常大的分子不会进入填充柱床，会在死体积内最先洗脱。大小适中的分子依据其体积的不同可以不同程度地渗透进微孔中（图 1），而最小的分子在微孔结构中扩散最深，从而最后洗脱。

图 1. 不同体积的分子以不同程度渗入固定相孔隙内

体积排阻色谱法适用于分离和定量蛋白质混合物，因此是重组蛋白生产过程中的一种重要质控手段。包括测定聚集体（二聚体、三聚体、四聚体等）以及从较大分子量的蛋白质中分离低分子量的辅料和杂质（图 2）。

图 2. IgG 聚集体和辅料的分离

 完整 lgG 单体和二聚体的分离条件   

洗脱顺序通常由分子量大小决定，分子量最 大的分子最先被洗脱，但 SEC 真正的分离机制是基于分子在溶液中的体积。大多数蛋白是紧凑型球形结构，但一些蛋白分子是圆柱形，因此可能会比预期洗脱更早，这是由于它们在溶液中有着更大的流体动力学半径（图 3）。此外，不同的流动相也会影响洗脱顺序，因为溶液中分子体积会改变（流体动力学半径或回转半径）。

图 3. 紧凑型球状蛋白与圆柱形蛋白的对比

 SEC-UV/DAD 方法开发指南   

针对生物分子、聚集体分析（肽、多肽和蛋白质）的基于体积的分离选择初始色谱柱和条件。

精彩亮相

安捷伦提供各种 SEC 色谱柱，可满足您的所有体积排阻分析需求。

此外，本篇应用文集中还包含 AdvanceBio SEC、Bio SEC-3 及标准品协助方法开发等简报，可供官网查阅，为生物治 疗蛋白质关键质量属性提供新方法，新思路。

AdvancBio SEC