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GB 31656.13-2021 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法

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内容节点
概述
实验/设备条件
样品提取
实验/操作方法
实验结果/结论
仪器/耗材清单

原理

试料中残留的硝基呋喃类蛋白结合态代谢物在酸性条件下水解,经2-硝基苯甲醛衍生化, 用乙酸乙酯液液萃取,高速离心净化,液相色谱-串联质谱测定,内标法定量。


7.1 水解与衍生化 取试料2 g(精确至±0.01 g),于50 mL聚丙烯离心管中,准确加入混合内标标准工作液50 μL,涡旋混合1 min,加盐酸溶液5 mL、2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL,涡旋混合1 min,37ºC 避光振荡16 h。

关键词:洗涤样品

要点:

Ø  GB/T 21311-2007之前的标准的样品在水解之前先用10 mL甲醇水洗涤样品,新标准在水解前是不洗涤样品的。

Ø  这一点需要注意,因为硝基呋喃类药物的代谢物在动物体内多数是以蛋白结合的形式存在,但有部分是游离态的,比如说SEM、AOZ。

Ø  目前没有明确的实验结论证明,硝基呋喃类药物的代谢物只是以蛋白结合状态存在,所以洗涤样品的时候会将游离态的残留物洗掉,从而影响结果的准确性。



8.2 提取净化 取出离心管冷却至室温,用磷酸氢二钾溶液调pH值至7.0~7.5,加乙酸乙酯8 mL,涡旋振荡1 min,6000 r/min离心5 min,取上清液至10 mL玻璃离心管,40 ºC氮气吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物,再将溶液转移至1.5 mL离心管中,以14000 r/min的转速离心10 min,取下层清液过0.22 μm滤膜,供液相色谱-串联质谱分析。

关键词:调pH值至7.0~7.5

要点:

Ø  大量研究表明,在 pH 为 7-7.5 的弱碱性条件下,乙酸乙酯对AOZ、AMOZ、AHD、SEM 衍生产物的提取效率最大(能达到 90%以上)。

Ø  因为弱碱环境可以抑制目标物的电离,使其绝大部分呈分子状态存在于衍生溶液中,有利于乙酸乙酯对目标物的提取或HLB 固相萃取柱的吸附,从而增强富集净化的效果。

Ø  但当 pH 值为 8-10 时,乙酸乙酯对 AHD 的萃取效率很低,因此需要将硝基呋喃代谢物酸性衍生溶液的 pH 值调节到 7-7.5 范围。


关键词:高速离心,0.22   um滤膜

要点:

Ø  相之前的标准,新标准增加了高速离心步骤(14000 r/min的转速离心),以及过0.22 um滤膜。

Ø  通过高速离心可以进一步净化试样溶液,把一些不溶于5%甲醇溶液的物质,通过高速离心沉淀下来,有部分的脂肪也可以通过高速离心分离出来。


Ø  另外,新增的0.22   um,为更好去除试样的杂质,保护色谱分析系统。

关键词:浑浊

要点:

Ø  最后一步用 5%甲醇水定容后出现浑浊,说明溶质过饱和(可能是样品的脂肪、蛋白等含量过高所致),通常是前处理过程中净化步骤不彻底导致的。

Ø  一般解决方法有两种:一是定容后置于冰箱(4℃)冷藏 2 小时以上,使脂肪充分析出,取出后高速冷冻离心,取上清液进行检测;

Ø  二是参考《GB/T   20752-2006》标准的处理方式——加入 10 mL 甲醇+水混合溶液(2+1)均质,然后离心弃去上清液再过 Anavo HLB 小柱净化效果更好。



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