对称分支肽的微波辅助多肽固相合成

摘要

微波增强的多肽固相合成（SPPS）可以合成具有对称赖氨酸分支的多抗原肽（MAPs）或多肽树枝状大分子，合成时间大幅降低，纯度提高。四分支酰基载体蛋白（ACP）肽的合成在2小时内完成，纯度为70%。四分支M10肽1（巴西副球孢子菌糖蛋白T细胞表位）的合成在4小时内完成，纯度为50%。在2小时内合成纯度为80%的一个八聚体，第三代赖氨酸-亮氨酸抗jun肽树枝状大分子（G3KL）2。

引言

对称分支肽（图1）代表一类具有非常理想的理化和生物学特性的肽。在一些情况下，由于与蛋白质靶标的多价结合或具有更高的蛋白酶抗性，包含分支核心的肽，如多抗原肽（MAPs）或肽树状聚合物有更高的生物活性3。因此分支肽已被用于各种治疗应用，包括开发抗微生物和抗病du药物4,5、肿瘤靶向剂6,7和药物输送载体8。

图1:左：对称分支的赖氨酸核心；

右：Fmoc-Lys(Fmoc)-OH

对称分支肽的合成可通过在SPPS中使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH来生成支链位置。合成通常比较困难，因为在分支支架上肽链固有的紧密接近性，会导致空间冲突和肽偶联不良。将微波能量应用于分支肽的合成克服了这些空间挑战，允许更有效的偶联和快速合成较少缺失的困难分支肽产物 (CarboMAXTM)。9

材料和方法

试剂

以下含有特定侧链保护基团的Fmoc氨基酸购自CEM公司(Matthews, NC)：Arg(Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OtBu)、Gln(Trt)、His (Boc)、Lys (Boc)、Tyr (tBu) 和Thr (tBu)。Rink Amide ProTide LL 树脂也得自CEM 公司。Fmoc-6-Ahx-OH 购自AnaSpec (Fremont, CA)。Fmoc-Lys(Fmoc)OH 获自 CreoSalus (Louisville, KY)。N,N'二异丙基碳二亚胺(DIC)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、3,6-二氧六环-1,8-辛二硫醇(DODT) 和三异丙基硅烷(TIS) 购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙mi(Et2O)、乙酸、HPLC 级水和乙腈购自VWR (West Chester, PA)。LC-MS 级水(H2O) 和LC-MS 级 乙 腈 (MeCN) 购 自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成：四分支ACP, (VQAAIDYING)4-(K)2-K-Ahx-KK-NH2

使用CEM Liberty BlueTM 自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide LL 树脂（离子交换容量：0.19 meq/g）上以0.1 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中进行脱保护。在 DMF (CarboMAX) 9中，五倍过量的Fmoc-AA 与DIC 和Oxyma Pure 进行偶联反应。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用带有 TFA/H2O/ TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系统进行切割。切割后，用无水乙mi沉淀肽并冻干过夜。

Tetra-branched ACP

多肽合成: 四分支M10, (LIAIHTLAIRYAN)4-(K)2-K-Ahx-KK- NH2

使 用 CEM Liberty BlueTM 自 动 微 波 肽 合 成 仪 在 Rink Amide ProTide LL 树 脂（离 子 交 换 容 量 ：0.19 meq/g）上 以 0.1 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和 Oxyma Pure 在DMF 中进行脱保护。在 DMF 中 5 倍过量的Fmoc-AA 与DIC 和Oxyma Pure 进行偶联反应( CarboMAX)9。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用带有 TFA/H2O/TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，用无水乙mi沉淀肽并过夜冻干。

Tetra-branched M10

多肽合成：G3KL 八聚体, (KL)8-(KKL)4-(KKL)2-KKL-Ah-KK-NH2

使 用 CEM Liberty Blue 自 动 微 波 肽 合 成 仪 在 Rink Amide ProTide LL 树脂（离子交换容量：0.19 meq/g）上以0.25 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中进行脱保护。在 DMF 中5倍过量的 Fmoc-AA 与DIC 和Oxyma Pure 进行偶联反应(CarboMAX)9。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，用无水乙mi沉淀肽并冻干过夜。

G3KL Octamer

多肽分析

在配备有 PDA 检测器的 Waters Acquity UPLC 系统上分析肽，该 检 测 器 配 备 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7mm 和2.1×100mm）。UPLC 系统连接到Waters 3100 Single Quad MS 用于结构测定。在 Waters MassLynx 软件上进行峰值分析。在 (i)H2O 和 (ii)MeCN 中以0.05% TFA的梯度洗脱进行分离。

结果

Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的使用微波增强 SPPS 合成四分支的ACP多肽，产生了 70% 纯度的目标肽（图2）。

图2：四分支ACP的UPLC色谱图

Liberty Blue 自动微波肽合成仪上使用微波增强 SPPS 合成在Liberty Blue 自动微波肽合成仪上使用微波增强 SPPS 合成 G3KL 八聚体产生了 80% 纯度的目标肽（图4）。

图3：四分支M10的UPLC色谱图

图4 ：G3KL八聚体的UPLC色谱图

结论

与传统的 SPPS 方法相比，使用微波增强的 SPPS 可以更快地制备对称分支肽，并且纯度更高。使用微波增强 SPPS，在2小时内合成了纯度为 70% 的四分支 ACP。四支化 M10 肽的常规室温合成需要超过42小时的手工劳动，目标肽的分离产率为 4%。

另一方面，微波增强的 SPPS 可在4小时内提供纯度为50%。G3KL 八聚体的常规合成需要超过35小时的手工劳动时间，并以 8% 的分离产率产生目标肽。2 将微波能量应用于 G3KL 八聚体的合成可在2小时内以 80% 的纯度提供目标肽 。

参考文献

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