热点应用丨小鼠肠道组织切片“全息”成像——拉曼光谱多光子成像

双光子荧光和二次谐波

双光子荧光(2PEF)和二次谐波(SHG)是研究生物样品方面的多光子成像技术。两种成像技术都利用飞秒脉冲红外激发光产生较短波长的光来对样品进行成像，通过不同的物理过程实现（图1）。在2PEF中，两个红外光子同时被荧光团吸收，使其进入激发态，然后辐射弛豫，发射较短波长的荧光。相比之下，SHG不是吸收和发射过程，而是两个红外光子结合在具有特定对称性的非线性光学材料中，产生恰好是入射光子一半波长的新光子。这两种技术都利用红外光的较低散射和吸收，来实现深入组织的成像。在本文中，天美爱丁堡仪器公司的RMS1000共焦显微拉曼光谱仪，使用2PEF和SHG对小鼠肠道的组织切片进行成像。

图1 双光子荧光 VS 二次谐波

样本：使用 Alexa Fluor® 568染色的小鼠肠道组织切片；RMS1000 配备电动 XYZ 载物台和 40x NA = 0.75 物镜；对于光学成像，RMS1000 配备了背照式CCD相机（可用于寿命成像）；以及，光子计数混合光电检测器和时间相关单光子计数 (TCSPC)器。2PEF 和 SHG 都需要非常高的激发强度，可使用锁模飞秒脉冲激光器实现的。RMS1000具有外部激光器耦合端口，可将飞秒激光器耦合到显微镜光路中。

2PEF和SHG的CCD相机光谱成像

使用RMS1000的CCD相机对小肠组织切片进行光谱成像。

样品的面积为900μm×800μm，空间分辨率为2μm。样品在1040nm、80MHz的频率下被激发，用CCD相机同时获得2PEF和SHG信号。多光子成像如图2a所示。Alexa Fluor®568染料在630 nm处的2PEF成像显示为蓝绿色，显示出肠绒毛的结构。粉色显示的区域是肠壁附近的纤维胶原蛋白，在520nm处的SHG信号。SHG只发生在非中心对称的分子结构中，纤维胶原蛋白是一种常见的具有这种生物结构的物质，可以引起强烈的SHG信号响应。图像中的每个点都有对应的光谱信号，A点和B点的光谱，如图2b所示。在A点，只有来自Alexa Fluor®568染料的2PEF信号，一个宽的发射峰在630 nm处，而在B点有另一个520nm的尖峰，这是SHG信号。通过分别绘制2PEF和SHG在630 nm和520 nm处的光谱强度，得到了图2a中的彩色图像。

图2 （a）用Alexa Fluor®568染色的小鼠肠道切片的2PEF和SHG图像

（b）从图像中选取两点的光谱图

混合光电检测器的2PEF寿命成像

通过双光子荧光寿命成像可以获得更多的信息。对于寿命成像，使用脉冲选择器将激光的频率降低到20 MHz，以确保脉冲之间的完全荧光衰减。利用光子计数混合光电检测器上的TCSPC，采样相同的900μm x 800μm区域，并记录了每个点的荧光衰减。使用RMS1000 Ramacle®软件对每个荧光衰减进行指数模型拟合，得到的寿命图像如图3a所示。寿命图像显示，与绒毛相比，肠壁附近的肠隐窝的荧光寿命降低；这是一个可以从寿命成像中获得更多样本信息的例子。

图3 （a）用Alexa Fluor®568染色的小鼠肠切片的2PEF寿命图像

（b）从图像中选取两点的荧光衰减

结论

采用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪的多光子显微成像技术，可以对小鼠肠道切片样本进行成像。RMS1000配备一个外部飞秒激光器和TCSPC，用于先进的光谱和时间分辨的多光子成像技术，如2PEF和SHG，增强了拉曼成像的核心能力。

爱丁堡共聚焦显微拉曼光谱仪

RMS1000

爱丁堡RMS1000是一款科研级、模块化共聚焦显微拉曼光谱仪，可以实现超高的光谱分辨率、空间分辨率和灵敏度。RMS1000的设计基于强大的专业知识和经典光路原理构型，结合现代光学设计，注重功能、精度和速度，在模块化和扩展性上形成独具一格的现代化显微拉曼光谱仪。RMS1000可以配置多达5个集成的窄带激光器，扩展外部激光器，可以实现拉曼成像、双光子成像、二次谐波成像、荧光寿命成像等功能，获得样品的全方位信息，适用于生物、组织切片类样品的无损、深层次分析。