FluorCam多光谱荧光成像技术应用案例——什么是多光谱荧光成像

内容节点: 概述; 实验/设备条件; 样品提取; 实验/操作方法; 实验结果/结论; 仪器/耗材清单

FluorCam多光谱荧光成像技术应用案例——什么是多光谱荧光成像

1. 多光谱荧光的发现及特性

二十世纪八九十年代，植物生理学家对植物活体荧光——主要是叶绿素荧光研究不断深入。激发叶绿素荧光主要是使用红光、蓝光或绿光等可见光。当科学家使用UV紫外光对植物叶片进行激发，发现植物产生了具备4个特征性波峰的荧光光谱。

图1. 左：烟草叶片上表面UV激发荧光光谱（Buschmann，1998）；中：多光谱荧光彩色光谱示意图；右：不同颜色激发光的荧光激发特性（Benediktyová, 2009）

这4个特征性波峰的波长分别为蓝光440nm（F440）、绿光520nm（F520）、红光690nm（F690）和远红外光740nm（F740）。这个特征激发荧光光谱就称为多光谱荧光（Multi-color Fluorescence，MCF）。其来源和荧光特性请见表1。

表1.UV激发多光谱荧光特性（Buschmann，1998，略有修改）

A．蓝绿荧光（Blue-Green Fluorescence，BGF）

荧光色素：

主要是细胞壁中共价结合的阿魏酸，由液泡中的肉桂酸和类黄酮调控

位置和来源：

a）细胞壁（主要来自于叶片表皮）

b）液泡（与溶解的酚类有相互作用）

激发：

UV

荧光特性：

辐射范围：

400-570nm

ZD值（波峰）：

440-450nm（蓝光，F440），520-530nm（绿光，F520）

胁迫指示：

蓝色荧光与红色和远红荧光比例：F440/F690，F440/F740的增加或减少；某些植物中绿色荧光的增加

B．叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence，Chl. F）

荧光色素：

叶绿素a

位置和来源：

叶片叶肉细胞，叶绿体

激发：

红光、绿光、蓝光、UV等

荧光特性：

辐射范围：

650-800nm

ZD值（波峰）：

690nm（红光，F690），730-740nm（远红光，F740）

胁迫指示：

短期胁迫：

荧光诱导动力学变化（通过叶绿素荧光技术进行分析），F690/F740增加30%

长期胁迫：

荧光诱导动力学变化（通过叶绿素荧光技术进行分析），叶绿素含量减少，F690/F740大幅增加。F690/F740是原位叶绿素含量的反向指标。

2. 多光谱荧光的发展

进一步的研究发现，并称为蓝绿荧光（Blue-Green Fluorescence，BGF）的F440和F520在正常生长的植物中强度很低。而在植物受到胁迫尤其是病害感染后，其强度才会显著上升。

与来源于光系统的叶绿素荧光不同，蓝绿荧光来源于一系列植物次生代谢物质，包括多酚、植保素、黄酮类、阿魏酸、苯丙素类等。这类物质在植物生长状态良好时含量很低，植物只有在受到胁迫后才会大量合成，这一方面是由于初级代谢受到YZ和干扰，另一方面这些次生代谢产物也是植物应对胁迫尤其是病害防御机制的重要组成部分。

F690和F740则属于叶绿素荧光，其强度与叶绿素含量和光合电子传递相关。F690 ⁄ F740认为与叶绿素浓度成负相关。同时F440 ⁄ F690，F440 ⁄ F740可以作为极早期胁迫指示指标，F440 ⁄ F520则反映长期胁迫变化（Pineda, 2008）。

3. FluorCam多光谱荧光成像技术

FluorCam多光谱荧光成像技术是在国际知名FluorCam叶绿素荧光成像技术基础上扩展升级而来的。这是目前国际上能够进行多光谱荧光成像分析的商用科研仪器技术，而且也是将多光谱荧光成像技术和叶绿素荧光成像技术结合为一体的商用科研技术。

目前，基于FluorCam多光谱荧光成像技术有三款仪器系统，分别为FluorCam一体式多光谱荧光成像系统、FluorCam模块式多光谱荧光成像系统、FluorCam落地式大型多光谱荧光成像平台，用于满足不同的实验需求。

图2. 左：FluorCam一体式多光谱荧光成像系统；中：FluorCam模块式多光谱荧光成像系统；右：FluorCam落地式大型多光谱荧光成像平台

FluorCam多光谱荧光成像系统除了可以进行多光谱荧光成像和叶绿素荧光成像分析，还可以扩展GFP成像、PAR吸收率成像、NDVI成像、QA再氧化成像、OJIP成像等成像分析功能。

FluorCam多光谱荧光成像系统与红外热成像、高光谱成像等其他植物表型成像技术结合，已经广泛应用于植物病害（细菌、病毒、真菌）、干旱、养分亏缺、重金属、除草剂等胁迫造成的次生代谢与表型组学研究，其中植物病害表型为主要的研究方向。

图3.左；细菌性甘薯茎腐病感染烟草的FluorCam叶绿素荧光与多光谱荧光成像分析；右：丁香假单胞菌感染菜豆的FluorCam多光谱荧光成像分析（Pérez-Bueno, 2016, 2015）

参考文献：

1. Buschmann C, Lichtenthaler HK. 1998, Principles and characteristics of multi-colour fluorescence imaging of plants, Journal of Plant Physiology, 152: 297-314

2. Benediktyová, Z. & Nedbal, L. 2009. Imaging of multi–color fluorescence emission from leaf tissues. Photosynthesis research 102, 169-175

3. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060

4.Pérez-Bueno M L, et al. 2015, Spatial and temporal dynamics of primary and secondary metabolism in Phaseolus vulgaris challenged by Pseudomonas syringae, Physiologia Plantarum 153: 161-174.

5.Pérez-Bueno M L, et al. 2016. Temporal and Spatial Resolution of Activated Plant Defense Responses in Leaves of Nicotiana benthamiana Infected with Dickeya dadantii. Front Plant Sci. 6: 1209

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A．蓝绿荧光（Blue-Green Fluorescence，BGF）
荧光色素：	主要是细胞壁中共价结合的阿魏酸，由液泡中的肉桂酸和类黄酮调控
位置和来源：	a）细胞壁（主要来自于叶片表皮） b）液泡（与溶解的酚类有相互作用）
激发：	UV
荧光特性：
辐射范围：	400-570nm
ZD值（波峰）：	440-450nm（蓝光，F440），520-530nm（绿光，F520）
胁迫指示：	蓝色荧光与红色和远红荧光比例：F440/F690，F440/F740的增加或减少；某些植物中绿色荧光的增加
B．叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence，Chl. F）
荧光色素：	叶绿素a
位置和来源：	叶片叶肉细胞，叶绿体
激发：	红光、绿光、蓝光、UV等
荧光特性：
辐射范围：	650-800nm
ZD值（波峰）：	690nm（红光，F690），730-740nm（远红光，F740）
胁迫指示：
短期胁迫：	荧光诱导动力学变化（通过叶绿素荧光技术进行分析），F690/F740增加30%
长期胁迫：	荧光诱导动力学变化（通过叶绿素荧光技术进行分析），叶绿素含量减少，F690/F740大幅增加。F690/F740是原位叶绿素含量的反向指标。