治 疗性寡核苷酸是由固相化学合成工艺生产。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物(分子量的差别:碱基数N-1、N、N+1等),磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此,杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。
液相色谱技术具有样品适用范围广、分离效率高、速度快等特点,已成为核酸药物生产与质控分析必不可少的重要手段。本期内容将介绍TSKgel色谱柱在寡核苷酸分析中的选择与应用。
01寡核苷酸的HPLC分离模式
下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。
02寡核苷酸的纯度检验
在离子交换色谱柱中,可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离,比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。
下图是TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。
03不同碱基数寡核苷酸的分析
在寡核苷酸的分析中,尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离,通常用于简单的质量控制或纯度研究。该模式的优点是可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行等度分离。有时也会添加水溶性有机溶剂来抑 制疏水吸附。
下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。
04脂质体包被的siRNA的SEC分离
下图是使用TSKgel SuperSW2000色谱柱对天然型DNA核酸药物Defitelio进行质量分析的示例。
参考文献:Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.
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