引起抗体药物制剂中可见异物与不溶性微粒风险的宿主残留蛋白（HCP）定量分析与研究

研究背景

宿主细胞蛋白（HCPs）是生物制品生产过程中产生的关键工艺相关杂质之一，除了我们熟知的可导致患者不良的免疫反应、超敏反应、引起蛋白降解等影响产品的安全性和有效性问题之外，近年来最 新的研究表明，HCPs 中的部分酯酶和脂肪酶参与了抗体药物制剂中吐温（聚山梨酯，polysorbate）的水解【1】。其中的一些脂肪酶和酯酶能够水解吐温结构中的酯键部位，生成游离脂肪酸和聚山梨醇，见下图 1。

图 1. 聚山梨酯 20（PS20）水解示意图

吐温是高度异质的混合物，容易通过多种途径发生降解，如化学水解、氧化水解和酶水解等。抗体制剂中吐温的降解不仅降低了表面活性剂的真实浓度，而且还与不溶性微粒的形成有关{2}。酶水解在目前被认为是在抗体药物中吐温降解的主要原因之一，如图 2。

图 2. 吐温水解通路示意图

由于酶催化吐温的水解反应在酶含量低至 ppm 水平时依然发生，因此建立 HCPs 酯酶/脂肪酶痕量水平的目标蛋白定量分析方法显得尤为重要。当前 HCPs 的分析方法当中，酶联免疫法（ELISA法）灵敏度高，能够检测到痕量 HCPs 残留，但是现有分析方法更加侧重 HCPs 总量的分析，缺乏针对导致吐温降解的 HCPs 酯酶/脂肪酶的目标蛋白分析方法，因此通用 HCP 试剂盒的 ELISA 方法检测到的 HCP 含量与吐温降解没有直接关联性。液相色谱高分辨质谱法（LC-HRMS）能够检测到不同种类的 HCPs，但是检测灵敏度不足，对于 ppm 水平含量的酯酶/脂肪酶无能为力。Agilent 创新应用中心使用 Agilent Infinity II 1290 接 6495C 三重四极杆质谱开发了 HCPs 定量方法。对于文献报道的导致吐温水解的5中酯酶/脂肪酶 {1}[3]，检测定量限低至 0.5 ppm，方法灵敏度高，特征性好，是目前最 佳分析手段之一。所开发的方法可用于不同应用场景下的 HCPs 酯酶/脂肪酶检测，如细胞株筛选阶段、纯化工艺过程监控，或者放行检测等。

基于吐温降解以及可见异物/不溶性微粒形成对抗体制剂稳定性的重大影响，在 HCPs 定量方法之外，Agilent 也在跟行业用户的合作当中，对吐温降解导致不溶性微粒的研究提供全面的分析仪器技术支持，包括吐温定量、吐温精细表征、游离脂肪酸含量分析（见以下往期微信推送链接），助力抗体药物行业健康发展。

实验方案

仪器和设备

1290 infinity II Bio 生物大分子专用超高效液相色谱系统，配置如下

• 二元泵（G7132A）

• 自动进样器（部件号 G7137A），配多通道进样清洗系统

• 柱温箱（部件号 G7116B）

色谱柱

Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18，2.1 x100，1.8um

质谱系统

Agilent 6495C 三重四极杆质谱

方法开发与验证

样品处理 [4]

1、酶解，取 1mg mAb 药物，加入 10ul 1M 碳酸氢铵溶液，5uL 0.5mg/ml 的胰蛋白酶（Trypsin），用超纯水补足至 200uL，37℃ 孵育 4 小时；

2、蛋白沉淀：样品取出恢复到室温，加入 2uL 50 mg/ml DTT 溶液，90 ℃ 下加热 10min，取出后 13000 转离心 2min，取上清液上机。

方法验证

本实验对照品来自 5 种 HCPs 酶的 8 个合成特征肽段。进行了基于 NIST mAb 的基质添加回收率测试，定量限测试，线性测试实验。最 后使用开发的方法检测了实际样品——这些样品分别来自实际发现不溶性微粒的过期样品和工艺过程样品。

相关分析结果见后续谱图。

图 3. 特征肽段 LLOQ 水平（0.05ng/ml）基质添加色谱图

图 4. 特征肽段标准曲线

图 5. 特征肽段 NIST mAb 添加回收测试

结 语

抗体药物制剂中吐温会发生降解，进而产生不溶性微粒的风险，其中 HCP 酯酶水解是吐温的主要降解途径之一

吐温降解与可见异物/不溶性微粒形成机制研究过程中，需要全面使用 LC/ELSD 和 Bio LC SEC/VWD/MALs 分析技术平台，LC/MS&LC-MS/MS 分析技术平台，LC-QTOF 分析技术平台

Agilent 在跟行业用户的合作当中，对吐温降解导致不溶性微粒的研究提供全面的分析仪器技术支持，助力抗体药物行业健康发展。

参考文献：

[1]. NR. Larson, Yangjie Wei, et al. Comparison of Polysorbate 80 Hydrolysis and Oxidation on the Aggregation of a Monoclonal Antibody [J]. J Pharm Sci. 2020 Jan;109(1):633-639

[2]. 贾东晨，何伍。抗体药物制剂处 方中的可见异物/ 不溶性微粒，《中国新药杂志》2022 年第31 卷第10 期

[3]. X Gao, B Rawal, Y Wang, et al. Targeted Host Cell Protein Quantification by LC−MRM Enables Biologics Processing and Product Characterization[J]. Anal.Chem. 2020,92,1007−1015

[4]. L Huang, Ning Wang, CE Mitchell, et al. Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies [J]. Anal. Chem. 2017, 89, 10, 5436–5444