【技术方案】微孔板内细胞固定和抗体染色自动化解决方案

以往，我们使用显微镜做荧光成像的时候，常常将样本放在载玻片上。但是随着样本量增加，细胞实验使用 96 孔和 384 孔微孔板逐渐成为趋势，这与高内涵（high-content analysis，HCA）分析不谋而合。

高内涵分析是一种高通量识别并分析由与细胞相互作用的物质所带来的细胞表型变化的方法。这些物质包括小分子、受体配体和 RNAi，它们可能引起——增加或减少特定蛋白质产生的表型变化、G 蛋白偶联受体（GPCR）的内化、核激素受体易位、细胞凋亡、蛋白质翻译后修饰的变化以及细胞形态的变化。虽然通过明场成像（透射光）可以观察一些细胞形态变化，但更多的形态学变化需要使用更有针对性的染色方案，比如抗体或者小分子荧光探针。

BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统支持高内涵成像与分析

无论使用何种抗体和荧光染料的组合，对于低背景的特异性染色，都需要一系列的试剂添加和清洗步骤来去除未结合的抗体或染料。

安捷伦 BioTek 406 FX 洗板分液系统是一个模块化的系统，具备分液和细胞清洗双重功能。406 FX 可以通过触控屏或者使用电脑上 LHC 软件进行控制和编程：

• 快速清洗 96/384 孔板，且无需更换洗头；

• 最 多 4 个注射器泵和 2 个蠕动泵分液器的组合允许同时添加 6 种试剂；

• 蠕动泵结合 1μL 卡夹，允许用户最 大限度的减少试剂制备量；

• 管路内的试剂可回收；

• 注射器泵支持快速批量分液。

406 FX 洗板分液系统

一台 406 FX 即可完成 96/384 孔板中制备细胞样品所需的试剂添加和清洗步骤。成角度分液头的独特设计，有效保护单层细胞不受加液和清洗影响。

下面我们就一起了解下 406 FX 细胞分液系统在如何代替手工，完成在微孔板中固定和染色细胞的工作流程。

实验方法

1、细胞培养与接种

将 HT-1080 细胞和 NIH3T3 细胞通过 406 FX 的蠕动泵 5μL卡夹分别接种到 96 孔板（黑色，透明底，货号：204626-100，安捷伦）中，再使用第二蠕动泵添加不含细胞的完整培养基，使得每个孔体积均为 200μL。

2、细胞固定、透化与荧光染色

所有固定、透化和荧光染色所需要的试剂添加和细胞清洗步骤均由 406 FX 来完成（图 1）。其中，对于昂贵的一抗和二抗，使用蠕动泵来添加，管路中的试剂可回收。

用于透化细胞的固定剂和细胞洗液则使用注射器泵添加。实验所涉及的试剂、抗体和染料和详细实验步骤请查看原文。

图 1. 固定和染色工作流程

3、细胞成像分析

使用安捷伦 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像系统对细胞进行成像和分析。Cytation C10 将共聚焦光路与宽场显微成像相结合，对于宽场成像，Cytation C10 将 LED 光源与高性能滤光片 cube 直接耦合，提供多色荧光成像，在本次实验中使用 DAPI、GFP、TRITC 和 CY5 四个荧光通道。对于共聚焦，Cytation C10 使用激光器结合转盘共聚焦的方式为有厚度的样本提供更优异的分辨率和光学层切能力。

图 2. HT-1080 细胞固定染色

使用 Agilent BioTek 406 FX 洗涤分配器进行液体处理，固定 HT-1080 细胞并对肌动蛋白（红色）、微管蛋白（绿色）、细胞核（蓝色）和线粒体（橙色）进行染色。使用 Agilent BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统用 40 倍物镜拼接成像（2×2）。

结果与讨论

1、可变细胞数接种准确性验证

通过接种不同体积的细胞悬液，可以改变孔中的细胞数量。本实验中，使用 406 FX 初级蠕动泵将相同细胞浓度的 NIH 3T3 细胞以不同体积接种至 96 孔板中，然后使用二级蠕动泵向孔内添加培养基，至每孔体积均为 200μL，固定细胞并使用 Hoechst 33342 染色后通过成像进行细胞计数，计数结果与接种细胞时基于细胞浓度预期的细胞数量具有良好的相关性（图 3）。

图 3. 可变细胞数接种

2、编程的灵活性验证

406 FX 可以根据不同的实验需求，在 2 个蠕动泵和 4 个注射器泵中灵活选择进行程序设置，比如实现一个简化版的固定和染色步骤。如图 4 中的 NIH3T3 细胞表达 GFP，仅使用 DAPI 和 Texas Red 鬼笔环肽进行复染，其固定和染色过程仅使用了洗板模块，一个蠕动泵和两个注射器泵。

图 4. 406 FX 固定和染色后的三色荧光成像图。表达 GFP 的 NIH 3T3 细胞用 exas Red phalloidin（actin）染色，用 DAPI 染核。10 倍物镜拍摄。

3、蠕动泵独立分液，降本增效

406 FX 蠕动泵的卡夹采用 8 通道设计，8个通道既可以分装相同的试剂，又可以分装不同的试剂。8个通道独立使用，在用来筛选荧光染料时可以节约染料和细胞，非常方便。图 5 展示的是使用蠕动泵将不同的荧光染料组合加入到 4 个细胞孔里染色后的细胞图像。

图 5. 不同荧光标记的 phalloidin 复染结果

使用 406 FX 固定 HT-1080，再通过蠕动泵加入不同的染料组合，(A) Hoechst 33342 only；(B) Hoechst 33342 and AlexaFluor 488 phalloidin；(C) Hoechst 33342 and AlexaFluor 555 phalloidin；(D) Hoechst 33342 and CF633 phalloidin

该方法也同样适用于检测抗体特异性，检测不同抗体的特异性时通常需要使用抗体阴性对照。如图 6 所示，通过 406 FX 的一级和二级蠕动泵将6种不同的抗体混合物分别加入两列细胞孔中，产生阴性对照：缺乏 rabbit anti-Tom20 一抗和对应二抗的孔不显示红色荧光，同样，缺乏 mouse anti-tubulin 和对应二抗的孔不显示绿色荧光。

图 6. 抗体特异性验证

图 6A 和图 6F 为一抗和二抗完全混合，而图 6B 到图 6E 各缺少一种抗体。使用 20 倍物镜，DAPI、GFP、TRITC和CY5通道成像。

结论

高内涵分析目前在药物发现过程中发挥着重要作用。基于显微图像的分析历来需要大量的手工样品处理，费时费力，并且容易产生可能导致伪影的错误处理。在这些繁琐、重复的步骤中使用自动化液体处理设备，不仅提高了效率、减少了技术人员偏差，同时也让研究人员得以将时间用在更重要的工作上。

406 FX 体积小巧，可以放入生物安全柜使用，进行无菌操作，也可以与自动化设备整合，进行自动化程度更高的样本制备流程。

Agilent BenchCel 微孔板处理器与 Agilent BioTek 406 FX 洗板分液系统和 Cytation 细胞成像多功能微孔板检测系统集成

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关于 BioTek

BioTek 是世界 领 先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司，拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果，配合友好强大的操作软件，为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学，促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司，成为细胞分析事业部的重要组成成员。

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安捷伦科技有限公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全 球领 导者，致力于为提升人类生活品质提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最 具挑战性的难题提供更可靠的答案。2022 财年，安捷伦营业收入为 68.5 亿美元，全 球员工数约为 18,000 人。