凝胶电泳

　　凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术。凝胶电泳在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。常见的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及脉冲场凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳

　　琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的Z主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

　　琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

　　蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为Z适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

　　琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。

　　化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

　　作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶;非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

　　不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

　　不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

脉冲场凝胶电泳

　　脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种重要的分子分型技术，其工作原理是：大小不同的DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间不同，一般较小的分子重新定向较快，在凝胶中移动快，大的DNA分子比小的DNA分子定向慢，在凝胶中移动比较慢，根据各DNA分子迁移距离的不同，从而可以达到分离不同大小的DNA分子的目的。在所有分子分型方法中，脉冲场凝胶电泳以重复性好、分辨性强，被作为细菌分子分型的“金标准”。

　　脉冲场凝胶电泳是一种非常有效的分子分型方法，在国外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究中。能够用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源，在疫情控制方面可发挥重要的作用。具体表现在以下几个方面:

　　1、研究菌株之间的遗传差异。

　　2、在表面上散在分布的病例中寻找可能的联系，通过监测及时发现暴发。

　　当今传染病暴发流行的性质发生了改变，即:暴发流行不再局限于某一地区，一段相对集中的时间里，由同一污染源引起的暴发流行，而是由多个传染源，在较长的时间段内，跨越省市甚至是国家的暴发流行。脉冲场凝胶电泳方法由于其自身优势而被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的暴发流行，还有助于识别散发病例的传染源。

　　3、可用于对已确认的爆发疫情进行传染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。

　　4、除了帮助流行病学调查外，细菌分型还能对病人的诊断和ZL提供线索，对连续继发性感染患者分离菌株进行PFGE分析可以区分是复发(单一菌株型)还是新的菌株引发的再感染。

　　5、脉冲场凝胶电泳也用于抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型，如耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌和耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌。

　　6、对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株进行相关性分析。

　　7、脉冲场凝胶电泳还可用于其他领域，如百日咳抗原性变异和脉冲场凝胶电泳的相关性。

凝胶电泳操作流程

　　准备干净的配胶板和电泳槽，注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

　　1、选择电泳方法

　　一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以;如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

　　2、正确选择凝胶浓度

　　对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

　　3、适合的电泳缓冲液

　　常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

　　4、电泳的合适电压和温度

　　电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

　　5、DNA样品的纯度和状态

　　是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

　　注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mmNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。DNA的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

　　6、Marker的选择

　　DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

　　7、凝胶的染色和观察

　　常用的核酸染色剂是溴化乙啶(EB)，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。