​分离纯化技术

　　分离纯化由各种化学工程的单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如吸附、萃取、蒸馏、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟。一般说来，分离纯化可分为四个阶段：①发酵液的预处理和固液分离;②初步分离(提取);③高度纯化(精制);④成品加工。

分离纯化技术发展史

　　生物学科的发展日新月异，基因工程、动植物细胞培养、传统发酵工程和酶工程等新技术、新产品层出不穷，这些新产品的获得均离不开各种分离手段的应用。随着对产品纯度和质量愈来愈高的要求以及科学技术的发展，分离纯化技术也不断得到发展。

　　1、古代酿造业

　　古代酿造业包括酿酒，制酱(油)、醋、酸奶和干酪等，技术原始，多属家庭式作坊，产物基本不经过后处理而直接使用，基本无下游技术。

　　2、diyi代生物技术

　　主要指19世纪60年代~20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。这期间发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。

　　到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业(主要是厌氧发酵)，其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。

　　3、第二代生物技术

　　以20世纪40年代出现的青霉素产品分离纯化技术为代表。开发了无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素(如链霉素)、氨基酸(如谷氨酸)、有机酸(如柠檬酸)、酶制剂(如淀粉酶)、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。此阶段借鉴和引进吸收了大量近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。

　　4、第三代生物技术

　　以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。生物技术在其主要领域(如基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程)取得了长足进步，一批高附加值的产品(如乙肝疫苗、干扰素等)开始面世。

　　20世纪80年代发现了一大批生理功能性物质，如活性多糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。分离纯化技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤技术、渗透蒸发技术、各种色谱(层析)技术等。

分离纯化方法

　　1、溶剂萃取法

　　当生物活性物质以不同的化学状态(游离状态或成盐状态)存在时，在水及与水不互溶的溶剂中有不同的溶解度。如青霉素在酸性下成游离酸，在醋酸丁酯中溶解度较大或分配系数较大，则当和发酵液相接触，青霉素就从水相转移到醋酸丁酯相中;而在中性下成盐，在水中溶解度较大，能从醋酸丁酯转移到水相，这样反复萃取达到分离纯化的目的。

　　2、离子交换分离法

　　利用离子交换树脂和生物活性物质之间的化学亲和力，有选择性地将生物活性物质吸着上去，然后改变条件以较少量的洗脱剂将其洗脱下来，达到浓缩和提纯的目的。利用此法，生物活性物质必须是极性化合物，即在溶液中能形成离子的化合物。如抗生素为碱性，则可用酸性离子交换树脂去提取;如抗生素为酸性，则可用碱性离子交换树脂去分离纯化。

　　3、吸附分离法

　　系利用吸附剂与生物活性物质之间的分子引力而将生物活性物质吸附在吸附剂上，然后再选用洗脱剂将其洗脱下来，达到分离纯化的目的。

　　吸附剂有活性炭、白陶土、氧化铝、各种离子交换树脂等。其中以活性炭应用Z广，但有很多缺点，如性能不稳定、选择性不高、可逆性差、不能连续操作、劳动强度较大等，因此该法曾几乎被淘汰，只有对新抗生素分离或其他方法都不适用时才考虑用吸附法。但1966年后，随着一种性能优良的新型吸附剂——大孔网状聚合物吸附剂的成功应用，吸附法又被广泛应用。

　　4、沉淀分离法

　　通常加入一些无机、有机离子或整个分子，能与生物活性物质形成不溶解的盐或复合物而自发酵液中沉淀出来。例如四环类抗生素在碱性下能和钙、镁、钡等重金属离子或溴代十五烷基吡啶形成沉淀，青霉素可与N，N'-二苄基乙二胺形成沉淀，新霉素可和强酸性表面活性剂形成沉淀。另外，对于两性抗生素(如四环素)可调pH至等电点而沉淀，弱酸性抗生素(如新生霉素)可调pH至酸性而沉淀。

　　一般发酵单位越高，利用沉淀分离法越有利。因残留在溶液中的生物活性物质浓度是一定的，故发酵单位越高，分离纯化率就越高。

　　5、化学萃取法

　　与物理萃取不同，在许多液一液萃取过程中常伴随有化学反应，包括相内反应与相界面上的反应。这类分离纯化统称为化学萃取(反应萃取)。

　　化学萃取是伴有化学反应的传质过程。根据溶质与萃取剂之间发生的化学反应机制，大致可分为五类。即络合反应、阳离子交换反应、离子缔合反应、协同反应、带同萃取反应等。

　　6、超临界流体萃取法

　　对一般物质，当液相和气相在常压下达到平衡时，两相的物理性质如黏度、密度等相差很显著，在较高压力下，这种差别逐渐缩小，当达到某一温度与压力时，两相差别消失，合并成一相，这时称为临界点，其温度和压力分别称为临界温度和临界压力。当温度与压力略超过或靠近临界点时，其性质介于液体和气体之间，称为超临界流体。例如二氧化碳的临界温度为31.1℃，临界压力为7.3MPa。

　　超临界流体的密度和液体相近，黏度和气体相近，溶质在其中的扩散速度可为液体的100倍，这是超临界流体的萃取能力和萃取速度优于一般溶剂的原因。而且流体的密度越大，萃取能力也越大。

　　变化温度和压力可改变萃取能力，使对某物质具有选择性。常用二氧化碳作为萃取剂，因其临界压力较低，操作较安全，且无毒，适用于萃取非极性物质，对极性物质萃取能力差，但可加入极性辅助溶剂(称为夹带剂，entrainer)来补救。

　　7、膜分离法

　　膜分离法(超滤法包括微滤、超滤、反渗透)是利用一定截留分子量的超滤膜进行溶质的分离纯化。小于截留值的分子能通过膜，而大于截留值的分子不能通过膜，因而达到分离。这个过程不发生相变化，也不需加入化学试剂，消耗的能量也较少。适用于膜分离的物质，分子量在500-1000000之间。

　　在小分子物质的分离纯化中，主要用于去除大分子杂质。在大分子物质的分离中，主要用于脱盐、浓缩。膜分离法的主要缺点是浓差极化、膜的污染、寿命较短和通量低等。

分离纯化技术的特点

　　分离纯化是从动植物组织、微生物培养产物或细胞培养产物中分离及纯化目的产物的过程。系统地研究生物分离纯化过程，能够揭示其内在的分离原理。利用这些原理，我们可以设计目的产物的分离纯化方法。

　　由于生物活性物质具有生理活性或药理作用，因此在分离纯化的过程中必须根据目标产物的特点，在保证其生物机能的前提下进行分离纯化操作。生物分离纯化的特点主要体现在以下几个方面。

　　1、目的产物浓度低，纯化难度大

　　原料液中目的产物的浓度一般都很低，有时甚至是极微量的，如yi腺中脱氧核糖核酸酶的含量为0.04%、胰岛素含量为0.002%，胆红素在胆汁中含量为0.05%～0.08%，但杂质的含量却相对较高，这样就有必要对原料液进行高度浓缩。

　　2、活性物质性质不稳定，操作过程容易失活

　　生物活性物质的生理活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的，目的产物大多数对热、酸、碱、重金属、pH值以及多种理化因素都比较敏感，容易失活。外部条件不稳定或急剧发生变化，容易引起生物活性的降低或丧失。因此，为维持生物活性物质的活性，分离纯化过程的操作条件都有严格的限制。

　　3、生物材料中的生化组分数量大，分离困难

　　原料液中杂质成分多，甚至目的产物与杂质的理化性质如溶解度、相对分子质量、等电点等往往比较相近，所以分离纯化比较困难。

　　4、生物材料容易变质，保存困难

　　生物材料容易腐败、染菌、被微生物的活动所分解或被自身的酶所破坏，甚至机械搅拌、金属器械、空气、日光等对生物活性物质的活性都会产生影响。因此，生物分离纯化方法的正确选择，对维持目的产物的稳定性起着至关重要的作用。

　　5、生物产品质量标准高

　　生物产品一般用作医药、食品和化妆品，与人类生命息息相关。因此，要求分离纯化过程必须除去原料液中的热原及具有免疫原性的异体蛋白等有害人体健康的物质.并且防止这些物质在操作过程中从外界混入。

分离纯化技术工艺流程

　　由于工业生物技术产品众多，原料广泛，性质多样，用途各异，且对产品质量与纯度的要求也可以是多方面的，因而其分离纯化技术、生产工艺及相关装备也是多种多样的。大多数生物产品的分离纯化过程按生产过程的顺序大致可分为四个类似步骤，即预处理与固液分离、提取(初步纯化)、精制(高度纯化)和成品制作，具体流程见下图。

　　1、预处理与固液分离

　　在这一步骤中，过滤和离心是基本的单元操作。为了加速两相分离，可采用凝聚和絮凝等预处理技术;为了减少过滤介质的阻力，可采用错流膜过滤技术。但这一步对产物浓缩和产物质量的改善作用很小。如果是胞内产物还要进行细胞破碎及碎片分离纯化。

　　2、提取(初步纯化)

　　这一步骤主要目的是除去与目标产物性质差异较大的杂质，通常目标产物要求有较大浓缩比，可选技术也比较多。典型的分离纯化方法有吸附、萃取等。

　　3、精制(高度纯化)

　　这一步骤主要目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质，所选技术要求对产物有高度选择性。典型的分离纯化方法有层析、电泳等。结晶特别是重结晶通常也能获得高纯度的产物。

　　4、成品制作

　　成品形式多种多样，有液态也有固态，美观的产品形态也是产品档次的一个标志。产物的Z终用途决定了产品的形式及Z终的加工方法。浓缩和结晶是常用的方法，大多数产品还必须经过干燥。