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纯化 蛋白质纯化

蛋白质纯化

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  蛋白质纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节,只有了解蛋白质的分子量、溶解性、等电点以及稳定性等基本性质,才能达到有效纯化。根据目标蛋白的物理或化学性质的不同,可以有针对性地采取不同的蛋白质纯化方法。

蛋白质纯化意义

  蛋白质是生命活动的物质基础,也是生物体内的功能性大分子。随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入,人们意识到仅靠基因组的序列分析来阐明生命活动的现象和本质是远远不够的,只有从蛋白质组学的角度来研究蛋白质,才能更好地把握生命现象和规律,揭示其本质。

  要研究蛋白质,首先要得到高纯度的、具有生物学活性的、相对稳定的目的蛋白质,然后才能对其性质进行研究,进而才可能大规模生产应用,以造福人类。而蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物的形式存在,不同类型的细胞中含有不同结构和功能的蛋白质,这就使得蛋白质纯化成为一项精细而复杂的任务。因此,GX的蛋白纯化技术和手段是蛋白质研究的基础和关键之一。

  蛋白质纯化的目的通常是为了获得纯品蛋白质,以便深入研究蛋白质的活性位点、活性机制、空问结构、结构与功能之间的关系,所以蛋白质纯化的意义在于:

  1、研究生命本质的需要从生物材料中纯化制备蛋白质,研究其结构与功能,对于了解生命活动的规律,阐明生命现象的本质有重大意义。

  2、工业生产的需要食品、发酵、纺织、皮革等工业需要大量高活力的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。

  3、YL的需要许多蛋白质是安全有效的药品,如蛋白水解酶复剂作为消化药物被广泛使用尿激酶可以ZL各种血栓性疾病等。

  4、基因工程的需要对具有生理活性的蛋白质和酶进行基因工程改造,以提高其生理活性、酶活力和蛋白质的热稳定性等,必须首先得到纯化的蛋白质,在纯品蛋白质的基础上再进行改造,如定点突变等。

蛋白质纯化方法

  1、基于分子大小差异的蛋白质纯化技术

  ①凝胶层析

  凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析,是利用凝胶的网状结构,根据分子大小差异纯化混合物的方法。由于该法上样量有限,常用在纯化的Z后一步,并与其他纯化方法(如离子交换)组合使用。纯化过程中,在保证原有生物活性的基础上考虑装柱、流速、洗脱液的选择以及其他影响因素,Z终确定合适的纯化条件。

  ②超滤

  超滤法是利用加压膜纯化技术,在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜,大分子溶质滞留,从而使大分子物质得到部分的纯化。该法操作简便、成本低廉、试验条件温和,不需加热,与蒸发、冰冻干燥相比没有相变化、pH变化,因而可以防止生物活性物质的变性、失活和自溶。

  ③透析

  透析是利用小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理,将无机盐等小分子与生物大分子分开的一种纯化技术,常和盐析、盐溶等方法联合使用。

  2、基于溶解度差异的蛋白质纯化技术

  ①等电点法

  等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度Z低且各种蛋白质等电点不同的特点进行蛋白质纯化的方法。

  ②溶剂法

  溶剂提取法包括水溶液提取法和有机溶剂提取法,其中缓冲溶液对蛋白质的溶解度大、稳定性好,Z为常用;而乙醇、丁醇和丙酮等有机溶剂具有一定的亲水性和较强的亲脂性,主要用于一些脂质结合较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。

  其中乙醇提取法溶解性能较好、溶出的水溶性杂质少、可回收反复利用。丁醇在一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶提取中更加优越,溶解脂的能力强,兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。

  ③双水相萃取法

  双水相萃取技术是一种新型的蛋白质纯化技术。它把两种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起,由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不溶性形成两相,与传统的纯化蛋白质纯化相比,具有操作条件温和、处理量大、易连续操作等优点,同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用,在粗提过程中保持了生物物质的活性及构象等优势。

  该技术现已成功地应用于纯化蛋白质、抗生素微生物离子、电泳纯化氨基酸等。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH、离子强度、盐类型及浓度的影响。

  反胶团萃取是指胶团内可溶解少量水而形成微型水池,利用胶团对外界有机溶剂的屏蔽作用,实现生物物质的溶解和纯化。该技术具有选择性高、萃取过程简单,正萃、反萃同时进行,能有效防止大分子失活、变性。其不足之处包括:普通离子型表面活性剂可能对产品产生污染;常用的离子型表面活性剂容易造成蛋白质的变性和失活,虽然活性损失较少。其影响因素主要包括表面活性剂种类以及浓度、离子强度、助表面活性剂、水相pH和温度等。反胶团萃取法还可提取蛋白质、酶、核酸、氨基酸和多肽。

  ④盐溶法及盐析法

  许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低,若稍加一些无机盐则溶解度增加,该现象称为盐溶;而当盐浓度继续增加时,蛋白质又会自动析出,该现象称为盐析。盐溶和盐析主要是通过影响蛋白质分子表面的电荷而纯化、纯化蛋白质。

  盐析法是粗纯化蛋白质的重要方法之一,常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、溶解度大等优点,现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、pH及温度等因素影响。

  上述两种方法纯化蛋白质后,都要采用凝胶过滤或透析除盐。

  3、基于电荷不同的蛋白质纯化技术

  ①离子交换层析

  离子交换层析是发展Z早的层析技术之一,目前已成为蛋白质纯化Z常用的手段。离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物质的衍生物为载体,在某一pH条件下,这些载体带有正电荷或负电荷,当待纯化蛋白质分子通过载体时,离子交换使蛋白质分子纯化。

  ②电泳技术

  电泳技术作为纯化蛋白质的手段之一,无论是单向凝胶电泳还是双向凝胶电泳,都是纯化度极高的蛋白质纯化方法,可分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳。获得纯化的蛋白质,均可用电洗脱或电转印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析。

  4、基于对配体亲和力差异的蛋白质纯化技术

  亲和层析是一种以样品的生物活性为依据的蛋白质纯化技术。分析膜蛋白方法是利用蛋白质能和某些专一分子可逆结合的特性而发展起来的层析技术。

  当蛋白质溶液通过层析柱时,其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合,不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体,从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开,而后利用高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶液洗脱目标蛋白,即可脱离层析柱上的载体。

  5、基于选择性吸附差异的蛋白质纯化方法

  疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合的特性进行纯化。在高盐溶液中,蛋白质会与疏水配基相结合,其他的杂质蛋白则无此种性质,从而使蛋白质初步纯化。该方法具有使蛋白质变性、仅适合部分蛋白质等缺点。

  6、其他蛋白质纯化方法

  反相GX液相色谱法是一种以疏水作用为基础的色谱纯化法,具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点,在蛋白质及多肽的纯化分析中得到了极其广泛的应用。

  分子印迹是一种识别聚合物特殊结合位点的技术。随着蛋白质纯化印迹聚合物的成功合成,蛋白质印迹技术已成为研究热点。

  GX毛细管电泳技术是20世纪80年代问世的一种GX液相蛋白质纯化技术,是经典电泳技术与现代微柱蛋白质纯化相结合的产物。目前,它已成为分析科学中Z具活力的方法之一,因其纯化效率高、分析速度快、样品用量少、抗污染能力强和易自动化等特点,被广泛应用于分子生物学、医学、药学以及高分子等多个领域。

  作为蛋白质产品纯化的主流技术,柱层析具有很高的纯化效率,通常采用固定床间歇操作方式,操作简单,但存在着载体利用率低和过程效率低的问题。

  采用连续逆流操作层析,蛋白质纯化效率和产率均有提高,对于难纯化体系,逆流层析过程是一种有效蛋白质纯化手段。

蛋白质纯化工艺

  纯化蛋白质的一般程序可以分为前处理,初级纯化,GX纯化,产品制备和贮存以及质量检测多个步骤。

  1、前处理

  纯化蛋白,首先应把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不丢失生物活性。

  动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮,以免受杂质的污染。油料种子Z好先采用低沸点的有机溶剂如yi等脱脂,然后根据不同的情况,选择适当的方法将组织和细胞破碎。

  细胞破碎的方法主要有四种:

  一是机械破碎:它通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎,如捣碎法、研磨法和匀浆法。

  二是物理破碎:通过各种物理因素作用,使组织细胞外层结构破坏,而使细胞破碎,包括温度差破碎法、压力破碎法和超声波破碎法。

  三是化学破碎:通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎。

  四是酶促破碎:通过细胞本身酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏而达到细胞破碎,这类方法也称为自溶法和外加酶制剂法。

  细胞破碎后,选择适当缓冲液把所要的蛋白质分离出来,并把细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。离心分离除去细胞碎片和杂质是常用的方法,它是通过借助于离心机旋转而产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质纯化的技术过程。

  在离心分离时,要根据拟分离蛋白质以及杂质颗粒的大小、密度和特性不同,选择适当的离心机、离心方法和离心的条件。下表所示为不同离心场下沉降的细胞组分。

  2、粗分级纯化

  当蛋白质提取液(有时还掺杂有核酸、多糖之类)离心或过滤纯化后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。

  这一步骤大多采用沉淀纯化方法,这种方法是通过改变条件或添加某种物质,使蛋白质溶解度降低,而从溶液中沉淀与其他溶质分离的过程。如下表列出了几种常用的沉淀分离方法和原理。

  3、GX分级纯化

  经初级沉淀纯化后,其目的蛋白质纯度增加至50%左右,也就是说杂质或其他非需要蛋白大部分被淘汰。根据目的蛋白纯化度的要求,应进一步纯化。

  GX分级纯化大都采用色谱层析纯化技术。经沉淀和浓缩的蛋白质样品一般经2~4步色谱层析纯化才能达到要求的蛋白纯度。层析技术也称为色谱技术,是一种物理纯化方法。

  GX分级纯化是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在两个相中,其中一个相为固定的(称为固定相),另一个相则流动的(称为流动相),并使各组分以不同速度移动,从而达到纯化目的。色谱层析方法按照其纯化的原理可分六种类型(下表)。

  因此,在蛋白质纯化设计过程中,应根据目的蛋白特有的理化性质来决定层析类型的取舍。

  4、纯化蛋白的干燥、结晶和储存

  浓缩与干燥都是蛋白质与溶剂(通常是水)分离的过程,在蛋白质的纯化过程中是一个重要环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂,如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分,也可以达到浓缩效果。干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥。

  结晶是以晶体形式从溶液中析出的过程。蛋白质的结晶是蛋白质纯化的一种手段。它不仅为蛋白质的结构与功能等的研究提供了适宜的样品,而且为较高纯度的蛋白质的获得和应用创造了条件。蛋白质在结晶之前,必须经过纯化达到一定的纯度。如果蛋白质纯度太低,不能进行结晶。

  通常的蛋白质纯度应当在50%以上,方能进行结晶。总的趋势是蛋白质纯度越高,越容易进行结晶,有些蛋白质在纯度达到50%时就可以结晶,而有些在纯度很好的条件下也无法析出结晶。所以,蛋白质结晶并非达到纯化,只是达到相当的纯度而已。

  纯化蛋白贮存一般在为-20℃为宜,浓度太低往往造成蛋白质立体结构和构型破坏,影响蛋白质的生物活性。

  5、蛋白质的定量和定性分析

  纯化后的蛋白质无论是作为实验室生物学研究还是工业化应用,都应进行定量和定性分析。定量分析主要是指蛋白质含量或蛋白质浓度的测定,常用的经典方法有定氮法、双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。

  蛋白质的定性分析,一般包括分子量、等电点、蛋白质纯度、氨基酸序列等。蛋白质分子量测定Z常用的方法是SDS-PAGE凝胶电泳分析;等电聚焦电泳分析(isoelectrofocusing)常用来测定蛋白质的等电点;通常用于蛋白质样品纯度测定的方法有物理化学法,如电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。

  此外,生物化学分析法以利用生物活性、免疫学特性的方法也在纯度测定中使用。对于不同用途的蛋白质样品应根据所要求的不同纯度,选用相宜的检测方法。蛋白质氨基酸序列分析已成为成熟的技术,大都利用氨基酸测序仪进行测序。

 


2018-08-10  浏览次数:8816
本文来源:https://www.yiqi.com/citiao/detail_1205.html
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