细胞培养

细胞培养技术介绍

通过细胞培养可以得到大量的细胞或其代谢产物，因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中Z核心、Z基础的技术。细胞培养也叫细胞克隆技术，指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织。

不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞器材设备

1、细胞培养基

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。

因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为Z重要的基础科学之一。

2、细胞培养器材

细胞培养所用的设施包括：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。

塑料器材——多孔培养板、培养皿、培养瓶

玻璃器材——培养皿、滴流瓶、刻度吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶

橡皮器材——橡皮制品（Z好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。

金属器材——剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头

其他物品——纱布、注射器和针头

细胞培养一般流程

1、培养准备

细胞培养准备工作量较大，对开展细胞培养异常重要，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。

2、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用KJ素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。

3、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

4、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，Z终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

细胞培养环境条件

简言之，即细胞需要什么就提供什么，道理是如此，真正能做到这点尚需时日，人们至今对细胞的生命周期控制机理认识不足，癌细胞虽然也来自正常细胞，但至今不知道究竟为什么癌细胞很难停止已经启动的有害分裂，尽管如此，人们长期的研究结果表明，离体细胞培养需要的基本条件就是下列细胞生理条件。

1、营养物

营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括：N 源、C源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。

在干细胞分化研究与应用中，关键是找到一种使干细胞分化成为所需细胞和组织的营养液。相同的人干细胞，放在不同的营养液中分化培养出人的各种脏器，这个昔日的梦想已经开始成为现实。植物细胞的组织培养技术已经基本完善配套。名贵花卉、中草药、脱毒马铃薯、组织培养莲菜苗等植物细胞与组织培养技术的不断完善，特别是由于组织培养液的商品化已经被广大农民普遍接受。

2、pH

过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。

3、温度

温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的Z适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失（变性）。细胞膜遇到高温后容易变态。在自然界，既有耐高温的细胞，也有耐低温的细胞。在极端情况下生长的生物对付极端环境的机制研究在生物进化和农业、环保、发酵工业中意义重大。

4、渗透压

细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布的数量不同，当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。

5、水

水是细胞需要数量Z大的物质，不同的物种、不同部位、不同生长期的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般随同细胞培养液一起考虑。

6、光

植物细胞和少数细菌需要利用光进行光合作用。

7、无菌条件

体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养Z基本的条件。

8、气体

动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。二氧化碳的作用：调节pH，有缓冲作用，没有刺激动物细胞呼吸的功能