凝胶色谱法检测食品安全的应用

目前我国的食品安全现状相当严峻，及时准确地发现食品安全隐患对于质量监督部门来说至关重要。由于食品样品基质复杂，有害污染物含量很低，同时越来越严格的Z大残留限量标准对分析方法提出更高要求.使得在日常检测工作中越来越需要更为有效的前处理方法和更加灵敏的检测技术。样品前处理是食品分析中的关键环节，它和后续的分析检测技术结合在一起，决定着食品检测方法的灵敏度和可行性;但前处理也是食品分析中的薄弱环节，它不仅需要耗费大量的时间，同时也是导致误差产生的主要因素。因此，研究和开发先进的样品前处理技术已经成为目前食品安全研究领域的热点之一。近年来，在各种样品净化技术中，凝胶渗透色谱技术以其突出的优点，越来越广泛地应用于各类样品的前处理过程中。

1 凝胶渗透色谱(GPC)的基本原理

凝胶渗透色谱(GelPermeationChromato-graphy.GPC)又称分子筛凝胶色谱，是20世纪70年代发展起来的一种净化手段。其原理是以多孔凝胶(如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酞胺等)作固定相，根据溶质(被分离物质)分子量大小不同从而达到分离目的。凝胶渗透色谱的分离过程是在一个装有多孔凝胶的色谱柱中进行的。当含有各种分子的样品溶液流经凝胶色谱柱时，各种分子在柱内同时进行着两种不同的运动:垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的孔内，只能分布在颗粒之间，所以在洗脱时直接沿凝胶颗粒的间隙流出，洗脱速度较快。小分子物质除可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进人凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进人和扩散，小分子物质的移动速度远落后于大分子物质，从而使样品中分子量大的先流出色谱柱，分子量小的后流出，这种现象叫分子筛效应，具有多孔的凝胶就是分子筛。通常GPC可以分离相对分子质量从400-107，的分子。利用这一分离原理，在对富含色素、蛋白质、油脂等样品进行净化时，可以考虑利用GPC将大分子的杂质去掉，再结合其他的净化方法进一步去掉小分子杂质以达到净化目的。

GPC与通常使用的柱层析区别主要是：柱层析是利用填充物、样品和淋洗剂之间极性的差别而达到分离目的;而GPC则是利用样品中各组分分子大小不同而淋出顺序有先后从而达到分离目的。淋洗溶剂的极性对分离的效果并不起决定作用，这对于净化含脂肪、色素较多的样品具有明显的优势。

2 凝胶渗透色谱仪及其使用溶剂

基于凝胶渗透色谱原理而研发的凝胶渗透色谱仪主要由输液系统(包括溶剂贮存器、输液泵、进样器等)、色谱柱、检测器、信号记录仪、控制系统等部分组成。自从1965年Waters公司的GPC200型凝胶色谱仪问世后陆续出现各种类型的自动化凝胶色谱仪。全自动净化装置除六通阀、净化柱、泵等基本组成外，还有样品采样系统、样品收集系统、供液系统、分离系统、检测系统及计算机控制系统等自动化程度很高的组成部分。

溶剂在输液泵的推动下,将进样阀中的样品带入凝胶柱进行分离,由紫外检测器确定每个峰的保留时间。馏分收集器根据检测器的信号自动收集馏分,实现物质的净化分离。目前国内使用较普遍的除美国J2Scientific公司的AccuPrepMPS净化系统，美国OI公司的AP-2000系统，法国吉尔森的GPC-S系统以及德国LCTech公司的GPC-ULTRA系统外，一些国内自主研发的产品也很多，可供大家选择。

在GPC净化系统中有多种推荐使用的溶剂，一般来说，在选择溶剂时，应该选择与仪器一起提供的色谱柱兼容的溶剂或溶剂混合物。目前，对于食品安全检测应用方面主要有如下溶剂系统。

2.1 乙酸乙酯∶环己烷(1∶1)乙酸乙酯

环己烷混合溶剂对于各种类型的样品净化效果都非常好，对蔬菜、水果和其它动植物中有机氯农药、有机磷农药、PCBs、杀真菌剂和其它半挥发物残留的净化都能满足。此混合溶剂对健康毒性低，是目前首推使用的溶剂。

2.2 二氯甲烷∶环己烷(15∶85)

此溶剂系统对含有机磷和含氯杀虫剂的高脂肪性样品效果很好，对水果、蔬菜、谷类等植物类样品的净化效果也较好，是同时净化这两大类样品的Z好选择。

2.3 二氯甲烷∶环己烷(1∶1)

此溶剂系统多用于含有机氯杀虫剂的动物和家禽等高脂肪样品的净化。它不适合同时检测有机磷和含氯杀虫剂，尤其是当使用ECD检测器时。

2.4 二氯甲烷∶正己烷(1∶1)

此混合溶剂引用USFDA方法，用于净化各种高油脂食品中的杀虫剂、除草剂。也能用于净化羊毛脂样品，检测有机氯、有机磷杀虫剂。

2.5 二氯甲烷此溶剂系统

二氯甲烷此溶剂系统是传统的EPA方法，能从土壤、沉淀物、废水中除去大分子和含硫化合物，能完成半挥发物BNAs、PCBs、有机氯农药的净化提取。但是，由于二氯甲烷消耗量大、对环境污染大，对废液的处理成本较高，目前已在许多国家禁用。

3 GPC净化的特点

与传统的液液萃取、索氏提取、活性炭吸附、固相萃取等净化方法比，凝胶渗透色谱具有净化容量大、可重复使用、适用范围广、自动化程度高等特点。

通常在利用不同粒径、不同活性、不同柱径的氧化铝、硅胶、氟罗里硅土、活性炭等柱或几种不同混合柱净化样品时常常会考虑柱子的容量，样品提取物中的脂肪含量不能太高，例如10~20g的氧化铝柱只有250mg脂肪的处理容量，因此对于脂肪含量高的样品来说柱吸附是远远不够的。目前商品化的GPC柱容量都比较大，特别适合处理脂肪含量比较高的样品，例如美国J2Scientific公司ExpressTMGPC柱(300×10mm)可以处理含500mg脂肪的样品。此外，GPC系统中的凝胶再生能力很强，且无可逆吸附，所以凝胶性能可保持较长时间，能够反复使用。

由于GPC是利用样品中各组分分子量大小不同而加以分离的，只要样品中待分离的物质分子量有差异GPC就能把它们分开，因此GPC分离的样品范围比较广，且分离效果基本不受样品分子的其它性质影响。事实证明,GPC净化是适应各种样品基体的Z全能、Z便捷的样品制备技术。

目前商品化的GPC系统都可以实现自动化，操作非常简单，只要用户设定程序后仪器就能自动运行，真正意义上解放劳动力，提高样品分析的效率。综上所述，GPC系统在残留分析中表现出样品适用面广、方法简单等特点，也正是这些特点使得这一技术被越来越多的用户所认可。

4 GPC在食品安全性检测方面的应用

凝胶渗透色谱作为一种样品净化手段，在国内外应用的已比较普遍，尤其是在富含脂肪、色素等大分子的样品分离净化方面，GPC具有明显的优势。目前此系统是从高分子量基体中分离出低分子量化合物的Z有效手段，已成为美国环保局(EPA)[1],美国食品药物管理局(FDA)[2],美国分析化学协会(AOAC)[3]以及欧盟委员会(EN)[4]法定的方法。

4.1 农药残留的提取净化

在动物性食品农药残留分析中,得到的萃取液往往脂肪含量较高,且由于极性与目标物即待测农药相近很难加以除去。由于农药的分子量(通常小于500)一般要远远小于脂肪的分子量(通常大于600)，因而可用GPC系统将二者有效分开。早在1972年Stalling等就报道一种利用聚苯乙烯凝胶，Bio-BeadsSX-2凝胶填料以及环己烷溶剂组成的凝胶渗透色谱净化技术。利用此技术有效去除鱼肉提取物中的脂肪，而且农药的加标回收率也比较理想。不久Johnson等改进凝胶渗透色谱技术中的凝胶-溶剂系统，他们利用Bio-BeadsSX-3凝胶和甲苯-乙酸乙酯(1∶3)洗脱溶剂对16种有机氯农药、3种多氯联苯农药、14种氯代苯氧型除草剂和7种有机磷农药的洗脱特征进行研究，同时对蔬菜和动物脂质的洗脱模式进行研究，通过研究不仅得到各种农药回收的定量结果，而且研究结果表明经过GPC净化后不再需要液-液萃取等净化步骤。1990年Daft等通过一个小体积置换泵发明GPC净化的自动化方法，这相比手动注射进样来说是一个大大的进步。自动化凝胶渗透色谱仪一问世就得到广泛的运用和推广，被食品以及环境分析工作者用于土壤、果蔬、谷物、动物组织中农药残留的提取净化。

同样在对水果、蔬菜、茶叶、烟草等颜色较重的样品进行农药残留分析时，样品提取液中往往含有大量的高分子色素物质，这些高分子物质聚集在气相色谱的进样口和分析柱上，造成色谱分离效率大大降低。采用GPC净化样品不仅可以延长昂贵分析柱的使用寿命，而且可获得较高的回收率，从而保证分析结果的准确性。李伟等分别比较弗罗里硅土、活性炭和凝胶渗透色谱三种方法对黄瓜样品的脱色效果，结果发现采用凝胶渗透色谱净化可有效去除黄瓜样品中的色素杂质,不仅保护ECD检测器，且样品处理过程简便,回收率较高。曾凡刚也发现经过GPC净化后各种有机氯农药的回收率及灵敏度均要高于未经净化的样品。

4.2 多环芳烃的提取净化

多环芳烃是一类致癌性很强的环境污染物，广泛存在于大气、水、土壤、作物和食品中，它是世界各国ZD监测的项目之一。对于某些富含脂质的天然食品及加工食品，因复杂基质的存在会对多环芳烃的测定产生干扰，采用一般化学方法如酸处理法、碱处理法等难以达到理想的前处理效果，而GPC技术在净化此类食品方面具有明显的优势。有报道称早在1975年Fehringer采用GPC技术从乳制品中提取多溴联苯，并且得到较好的回收率。当加标浓度在0.1~0.5mg/kg范围内时，回收率为94%~104%,平均回收率为99%。张磊等以凝胶渗透色谱系统处理食品样品中的脂质，建立快速有效的多氯联苯(PCBs)分析的前处理技术。对油脂样品的检测结果显示，13C标记PCBs定量内标的回收率及RSD均符合EPA1668a方法的要求，20种天然PCBs的加标回收率在71%~122%。

4.3 食品安全检测中的其它运用

由于GPC系统是完全按体积大小分离的，因此其适用面比较广，被广泛用于食品中各类添加剂及非法添加剂的检测过程中。穆同娜等研究食用油脂样品中抗氧化剂BHA、BHT的测定方法，该方法采用凝胶渗透色谱对样品进行脱油脂处理,用气相色谱仪(FID检测器)进行定量分析。与国家标准GB/T5009.30-2003《食品中BHA与BHT的测定》相比,该方法使样品前处理步骤得到简化,操作方便,提高测定的准确性与灵敏度,非常适用于油脂及富含油脂食品中BHA、BHT的检测。

宋欢等建立凝胶渗透色谱-GX液相色谱同时检测辣椒及其制品中对位红和5种苏丹红的方法。此方法中样品经环己烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)提取后采用凝胶渗透色谱(GPC)净化，去除辣椒中的色素等杂质，且净化后的样品无任何干扰，样品的加标回收率为90%～102%，6种染料的检出限均为0.01mg/kg。该方法具有快速、有效、简便、自动化程度高、引进误差小、选择性和回收率高等优点。此外，GPC还被用于水产品中抗生素、谷物和饲料中黄曲霉毒素、动物肝脏中抗凝血剂、灭鼠剂等的安全检测。

5 凝胶渗透色谱法存在问题以及解决措施

5.1 分离不完全

GPC净化方法是一种分离大分子类干扰杂质的方法，能把农药等从各种复杂基质中分离出来，其分离效果的好坏取决于分子的大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异，因此对于分子尺寸相同的混合物来说分离效果比较差。另外，由于小分子干扰物可能会被夹带洗脱到农药中，而较大分子的农药可能会随着油脂等干扰物先流出，影响回收率。因此，在实际使用中要结合其它前处理方法来实现对复杂样品的富集净化。

5.2 溶剂消耗大

由于GPC柱内径较大，连续处理样品的能力相对较慢，造成溶剂耗费量也较大，而且由于收集体积大使得实验室现有的普通浓缩技术成为制约整个分析速度的瓶颈。为解决这些不足，目前商品化的全自动GPC净化仪都朝着净化柱内径小、载荷量大以及小体积进样的方向发展，减少溶剂的消耗量。此外，新一代在线浓缩GPC系统的研制，使得浓缩过程能与GPC同步，且浓缩速度快。此系统能够自动完成溶剂转换，用户可以自由设定终点体积，满足定量浓缩后直接上色谱分析的要求，大大提高GPC净化的分离效率。

6 结语

GPC净化技术是近几年发展起来的样品分离技术，从发现至今，已经取得很大的进展。由于其独特的净化特点和优异的净化效果，受到广大食品安全检测工作者的极大关注，被广泛用于食品安全检测的各个领域。GPC仪器的自动化大大改善食品安全检测工作的质量和效率，对实现食品安全监控的自动化具有现实意义。但由于GPC只是依靠分子量大小不同进行分离的，因此技术本身具有一定的局限性。但是，随着人们对健康饮食的更加关注，对食品安全的更加重视，相信GPC必将在未来的食品安全检测领域发挥越来越强大的功能。