1.定义
流式细胞仪(flow cytonletry,FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量,且在统计学上有效。
2. 原理
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
3.操作步骤
制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓
用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106~1×107/ml ↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓
弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
↓ 4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓
加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入 1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察, 视细胞浓度加入100~500μl固定液) ↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5~7天)
4.试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
5.注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,红外碳硫仪以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释 KH2PO4 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml FCS 50ml (终浓度 5%)
4%NaN3 50ml (终浓度0.2%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2%) 甲 醛 10ml
NaN3 0.2g (终浓度0.02%)
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