流式细胞仪的应用

一. 概述及基本原理

1  概述

流式细胞技术(FCM)是70年代发展起来得一种快速对单细胞定量分析的新技术,它借簦了荧光显微镜技术,同时利用与荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理,因而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段.目前,该技术已经广泛用于基础研究与临床应用,在免疫学,遗传学,血液学,肿瘤学等领域内发挥前重要的作用。

 2 基本原理

流式细胞仪的主要结构可以大致分为这样几个组成部分:激光系统,流式系统,信号处理及放大,计算机系统。当待测标本被制务成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室内充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当二者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发出特定波长的荧光,通过一些波长选择通逶性的滤色片,我们可以将不同波长的散射光,荧光信号区分开来,并送到不同的光电配增管中,经过一系列信号转换,放大,数字化处理,我们就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率.选择不同的单克隆抗体及荧光染料,我们可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便于进一步培养,研究。

二. 流式细胞仪在免疫学中的应用 

1.淋巴细胞亚群分析

淋巴细胞是正常机体免疫系统功能Z重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,未梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群，各亚群的数量和功能了生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化，FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态,指导ZL。

2. 感染及其治LX果观察

由于T淋巴细胞在人体免疫系统中承担着重要的功能,因此,当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度.例如,细胞膜外CD4分子有HIV识别部位,因此CD4细胞是HIV病毒受体,AIDS病人CD4+T细胞明显减少,该指标是诊断AIDS的重要标志.当病毒感染发生时(如乙型肝炎,EB病毒和巨细胞包涵体病毒),CD8+T细胞增多,对CD8细胞的测定有助于对感染的诊断,治LX果的动态观察。

利用流式细胞仪可对器官或移植后病人进行监控，当病人CD3+,CD25+持续增加提示已经开始发生排异,CD4/CD8持续下降表明有感染发生,当其比值小于0.2时必须停用免疫YZ剂。

由于流式细胞仪将静态的,显微镜下肉眼观察改为动态的,计算机信号处理,因此,在流式细胞仪上T细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数200个细胞成为几秒钟内计数上万个,因此结果更真实,更具有统计意义。

3. 其他免疫功能性疾病分析

流式细胞仪便捷,准确的特点可以用来对自身免疫性疾病进行检测与LX观察. SLE病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度.活动或非活动性SLE伴有多系统疾病但无肾脏损害的病人可出现CD4/CD8比值升高,伴有严重肾脏损害的SLE病人可出现低CD4+,高CD8+的现象。

有证据表明外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性,利用流式细胞仪可以进行HLA-B27/HLA-B7双标记来检测HLA-B27阳性细胞,同时排除交叉反应.另外,CD23表达的增加与变态反应性疾病,自身免疫性疾病,肾病综合症有关,而且阳性率与病情严重程度呈正相关,ZL有效后CD23+细胞减少。

利用流式细胞仪检测PNH血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)锚连接的蛋白如DAF(CD55.)与MIRI(CD59..)来确诊阵发性睡眠性血红蛋白尿传统的血清溶血试验具有更高的特异性与灵敏度。

一. 流式细胞仪在血小板功能评价方面的应用

血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血,血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要得黏附分子，用搞GP..的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,用FCM分析单个血小板或血小板亚群GP是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展,方法简便,快速,标本用量少,灵敏度高,结果准确. 与血小板有关的抗原的临床意义有:

1. 诊断遗传性血小板功能缺陷疾病

巨血小板综合症(BSS)患者血小板CD42 A\CD42B复合物先天缺陷,FCM中表现CD42A与CD42B不仅严重缺乏,而且其平均荧光强度显著低于阴性对照,CD61代偿性增加。

血小板无力症(GT)患者FCM表现血小板GPIIB,IIIA(CD41,CD61)明显缺乏,CD42A和CD42B基本正常或稍高,并可出现异常血小板亚群。

2.血栓性疾病和血栓前状态

由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度与疾病发SF展有关.CD62P..和CD63是活化血小板Z特异和灵敏的分子标志物,正常人血小板只有低水平活化,外周血CD62P只有3-5%. 。有文献报导糖尿病伴有微血管病变,冠心病,高血压病.高血脂病,脑血栓形成,脑动脉硬化患者活化血小板百分率和数显著高于正常人,而糖尿病无微血管病变,周围血管病以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者CD62P..和CD63增多,FCM可用于测PTCA后急性缺血再发作的危险性。

三. 流式细胞仪在白血病中的应用

血液病多种为肿瘤性免疫性和遗传性疾病,但恶性血液病约占一半以上。FCM在血液病的发病机制,诊断,分类,ZL和预后判断方面都有广阔的应用前景。

1. 白血病的分类研究

白血病分类是选择化疗方案和判断预后的重要依据.由于血细胞在其分化的不同阶段,承担不同功能时有不同的特征抗原表达,因此FCM结合单克隆抗体可以提高白血病分类诊断的附和率,根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原,可将它分为B细胞系,T细胞系,髓细胞系,红细胞系和巨核细胞系,可确诊白细胞的分类和分期,并可探明慢粒急变时的细胞来源。

2. 微小残病变检出(MRD)

MRD是白血病复发的主要根源,..FCM其高特异性与敏感性可以在患者缓解期检测是否有残存病变细胞,早期探测MRD,以避免复发。

四. FCM在肿瘤学上的应用

1. DNA含量测定及细胞周期分析

FMC在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出,化疗指导以及预后评估等工作。

大量工作表明,癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致,而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系。FCM通过精确定量DNA含量,能对癌前病变的性质和了展趋势作出判断,有助于癌变的早期诊断。

DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志,目前病理学尚无法从癌前病变中发现癌变和即将癌变的细胞,而FCM检测中DNA非整倍体细胞的出现可作为一个有价值的参数。

DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的诊断,如卵巢的交界性肿瘤,异倍体的出现与病变的恶性发展有关。

细胞异常增殖和分化障碍是肿瘤细胞的特性,DNA含量不仅能非常敏感地反映细胞代谢的异常,而且能通过DNA倍体分析,细胞周期各时相的细胞比例分析并结合细胞抗原的表达多参数分析,全面了解细胞的生物学行为,从而帮助肿瘤的诊断,选择ZL方案和预后判断。

DNA异倍体,高S_PHASE细胞比值和高增殖细胞核抗原(PCNA)表达与细胞增殖能力,恶性程度和不良预后呈正相关。

2. 为ZL方案和药理学研究提供依据

不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感程度是不同的.可以利用FCM进行细胞 期分析,适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物。

MDR是由多药耐药基因编的P糖蛋白(PGP)是亲脂化合物,包括多种药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排出荧光染料与细胞内P-GP的含量直接相关.当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,病人对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其他ZL方式。

五. 活细胞内活性酶的检测

据资料显示活细胞内活性酶的分析可以应用在许多医学领域.根据酶的活性可以鉴别不正常细胞,酶的活性也会因为受到药物的作用而会有所改变,因为酶的活动牵涉到细胞的新陈代谢,所以测量细胞内酶的活性能够提供许多细胞进展的讯息,包括活化,分化,凋亡,成熟,增殖等.传统上应用的测定细胞中酶的活性的方法(如FLUOROMETRIC及COLORIMDTRIC_ASSAYS),都是测定总体细胞的总酶活性而非测定单一细胞的酶活性.若要测定单一细胞的酶活性,通常都是涉及固定后的死细胞.近来COULTER公司推出Z新的技术及试剂CELLPROBE_REAGENT,由于每一个特定的酶都有其专一的受质,而受质本身是由特别的化学品与荧光染料

FLOURENSCEIN或RHODAMINENO共价结合的,能迅速进入活细胞,当其遇到特异性酶时,会被酶破坏其共价结构而释放其荧光染料,从而能够被FCM检测到,因此,活细胞酶探针能够用来测量单一活体细胞内酶的活性。

六. 凋亡细胞检测

凋亡Z初是作为形态学概念被提出来的.细胞有两种不同的死亡方式.即坏死(MECROSIS)和凋亡(APOPTOISI).凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片断,Z后形成数量不等的凋亡小体。

利用FCM可以进行DNA断裂点标记检测.DNA片断可以从细胞内漏出,导致DNA含量减少,利用FCM进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。

在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达,例如FAS基因蛋白(CD95),线粒体膜蛋白(AP027),磷脂酰丝氨酸(ANNEXIN_V),FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞,从而确定细胞的凋亡情况。

自70年代流式细胞仪成型以来,历经20多年的发展,流式细胞仪应用意义越来越得以体现,尤其是1982年以后,随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展,给流式细胞仪的应用发展提供了强大的推动力.在我国,不仅许多科研单位早在80年代已经开始使用流式细胞仪作为其科研工具,进入90年代后,以库尔特原理及其相关血细胞分析产品的美国库尔特公司以其在流式领域研究,应用近二十年的积累,在其五代流式细胞仪的基础上推出了以单激光同时激发四色荧光的新一代临床型流式细胞仪,并为其配套了临床标本制备仪,使临床标本制备标准化,简单化,开创了流式应用的新领域.从而,不少大中型医院也逐步引进流式细胞仪作为临床诊断的辅助工具,随着单抗技术,计算机技术及其它相关技术的不断发展,流式细胞仪将会在应用领域得到不断的开拓,成为科研与临床不可或缺的重要手段。