凝胶过滤色谱仪操作规程

凝胶过滤色谱操作规程

Gel  Filtration  Chromatography

Ø 仪器型号：Lc-10ADVP

Ø 仪器厂商：日本岛津公司SHIMADZU

Ø 启用日期：2005.3

Ø 仪器组件：泵Lc-10ADvp、示差检测器RID-10A、

控制器SCL-10Avp、柱温箱CTO-10ASvp

Ø 可测项目：① 适合水溶性物质（如蛋白质、多肽、多糖、DNA、RNA、水

溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子等）的分离和定量分析

② 水溶性多组份体系的分子量分布测定。

测试步骤：TSK 2500柱子，分子量测试范围3万以下。TSK 4000柱子，分子量测试范围百万以下。

1． 实验准备：换流动相瓶中水，超声10min赶走气泡，检查废液瓶等。

2． 开稳压电源、电脑，打开仪器四组件的电源开关（检测器2500柱子开紫外，4000柱子开示差RID）。

3． 赶气泡（一般更换流动相后需要赶气泡），打开泵的排液阀（逆时针旋转180度），（此步骤非常重要！）按LC-10AD面板上的purge键冲洗泵并赶气泡，等purge自动停止后（观察排液管中无气泡跑出），关闭排液阀（顺时针旋转180度），此过程一般需几分钟。

4． 开启软件CLASS-VP，点击Instrument 1进入控制界面，在LC Setup Assistant-System页面点击组件图块，在跳出的Instrument Setup界面上编辑方法，主要是设置流动相流速、柱温箱温度和运行时间，设置完毕保存方法（一般不需修改，使用原来方法即可）。点击快捷键Instrument on，使用该方法控制仪器。

5． 示差检测器：点击快捷键RID R.flow on，等10min后再次点击RID R.flow off（即按钮弹起），再过10分钟，点击Balance RID（平衡示差检测器），注意整个流路的压力值（泵组件上的示数），与记录本上前一天的压力值对比（如压力值变化大，可能要清洗流路）；

紫外检测器：没有此步骤

6． 等炉温升到40℃，界面“ready”后走基线。用菜单Control-----preview run观察基线，可用快捷键Zeros将基线归零。一次走基线需要25min，如果基线不平（在+1uRIU到-1uRIU内变化可认为平稳），可多次用菜单Control-----preview run走基线，直到平稳。

7． 基线平稳后可进样，标准溶液或样品需要用0.45μm的膜过滤。点击Control-----Single Run，在对话框中设置名称、路径，在状态栏上显示“Waiting for Trigger”时，可准备进样。

8． 取下进样口的保护套、保护针头，用注射器吸取50uL左右的标准溶液或样品，注意不能有气泡，轻轻擦拭针头，水平插入注射孔，然后将手柄逆时针扳至Load位置----------注射（速度要快）----------顺时针扳手柄至Inject位置，进样完成，此时可将注射器拔出，保护套重新盖上。

9． 进样后测试自动开始，观察图形，如果感觉方法中预设置Run time不够，可用Control-----Extend time在run状态下追加时间。

10． 依次将各标准溶液做完后，可用脱机程序Offline Processing处理数据。

11． 关机：全部样品分析完毕，用专用注射器清洗进样口，然后关泵，用仪器侧面的专用冲洗管冲泵（注射器抽取水，从冲洗管一端打入，废液从一端流出），再次开泵，冲洗流路。点击快捷键柱温箱升温炉Oven off。

12． 当Oven温度降至室温，并且冲洗流路时间超过1h后，点击快捷键Instrument off，切断软件与仪器硬件，退出程序，Z后关闭仪器各组件电源开关，关闭电脑。

附录A 标准曲线的绘制及定量分析未知样含量

1． 依次分析几个浓度点的标样，保存名称，如STD001.dat，STD002.dat，STD003.dat

2． 打开上列任一谱图，定义需定量的峰：①设置积分参数Method------Integration Events（识别峰的条件）；②点击Analysis------Analyze（标出峰位置）；③定义峰，在图谱上点击右键Graphical programming--------Define peaks，然后在峰前峰后各点一次，对话框显示参数，OK关闭，保存方法；④查看峰定义及设置各标准点浓度，Method------Peaks/Groups，对话框中填上峰名称、标准曲线类型、各点浓度等，关闭，保存方法。

3． 编辑处理序列：①编辑序列Sequence------edit，在对话框相应位置填上几个标样的文件信息。Filename依次填入标样文件名，Method填入前面编辑保存的方法，Level依次填入序号，Run Typediyi点选Clear all Calibration，Begin Calibration，Z后一个点选End Calibration，中间各点选Calibration。关闭并保存序列File----Sequence----Save as；②序列处理Sequence-----process，对话框中选Start即可。

4． 查看标准曲线Method------Review------Calibration。

5． 未知样定量及报告输出：①打开未知样图谱File----Data----open②用当前方法处理Analysis----Analyze③查看报告Report----View-----External Standard。

附录B 水溶性多组份体系的分子量分布测定

1． 用不同分子量的水溶性物质配成混合标样，分析，得到谱图；

2． 在Class-VP软件上打开该谱图，Analysis----Analyze，此过程存了一个*.D**的数据文件（专用于GPC软件），打开GPC for Class-VP软件，打开该数据文件File----Load LC Data，则谱图显示在Chromatogram界面上。

3． 在谱图上拖动将峰选中，在跳出的对话框中确认得出的峰位置和个数，在Calibration Curve Table上填入各个峰的分子量-----Draw，在Calibration Curve上画出了标准曲线，保存方法。

4． 点击快捷键Calc计算未知样的分子量分布：选择要分析的数据文件------Calculation，则得到未知样的积分、微分图，点击快捷键Slice/Peak/Average Molecular Weight等，可得出各未知峰处、整个样品的平均分子量，从Superimpose-----Graph Superimpose上可以得到各分子量的百分含量。

注意事项：

1． 流动相和样品都应经过超声脱气过程，已防带入气泡。并用0.5μm的膜过滤。

2． 一般来说，柱温箱的温度高于室温，因此试验完毕，不要立即停泵，先关柱温箱炉子，等柱温降到室温一下，再关泵。否则，在待柱子冷却下来后，可能由于液体收缩导致气泡进入柱子。

3． 柱子使用条件：

4． 适用pH范围：2.0~12.0。

5． 流动相可采用盐溶液和缓冲溶液：如硫酸钠、醋酸钠、磷酸二氢钠、醋酸铵、甲酸铵等；缓冲溶液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。考虑到粘度必须与蒸馏水接近，盐溶液的浓度必须低于0.5mol/L。

6． 样品准备：将样品溶解在所使用的流动相中，调整pH、盐浓度，尽量避免不必要的积盐。用0.5μm的膜过滤。

7． Polyethylene glycol标样准备：0.1％w/v，缓慢加热至40℃，保持1h；高分子量标样需要保持几个小时以保证充分溶解。

TSK gel G2500PWXL柱子现在使用的标准样品为：聚苯乙烯磺酸钠(PSS)

TSK gel G4000PWXL柱子现在使用的标准样品为：聚乙二醇（PEG）聚氧乙烯（PEO）