高速逆流色谱仪相关原理

　　1.高速逆流色谱技术的原理

　　高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。 

       2.高速逆流色谱色谱仪的基本配置

　　仪器的ZX部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于ZX轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕ZX轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕ZX轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的ZX轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，Z后用恒流泵压入移动相，同时启动ZX部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次Z多进样可达20g粗品;较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，Z大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。

　　在常用的HSCCC基础上，有人提出双向模式的高速逆流色谱" (dua-mode counter crurrent chromatography简称Dccc)，即前一次的流动相作下一次的固定相，洗脱方向相反。与常规的HSCCC相比，Dccc可以降低制备时间，免去柱冲洗时间，提高分离效率，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。但目前由于溶剂体系系统不完善，应用范围较窄。

　　高速逆流色谱法的技术特点

　　1.应用范围广，适应性好

　　由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。 

       2.操作简便，容易掌握

　　仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。 

       3.回收率高

　　不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。 

        4.重现性好

　　如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。 

       5.分离效率高，分离量较大

　　由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。 

       6.分配系数

　　溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。目前，分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。