扫描电子显微镜(SEM)是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具,主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态,即用极狭窄的电子束去扫描样品,通过电子束与样品的相互作用产生各种效应,其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像,这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的,即使用逐点成像的方法获得放大像。
扫描电镜的优点
扫描电镜的优点是:
①有较高的放大倍数,20-20万倍之间连续可调;
②有很大的景深,视野大,成像富有立体感,可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构;
③试样制备简单。
目前的扫描电镜都配有X射线能谱仪装置,这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析,因此它是当今十分有用的科学研究仪器。
扫描电镜的结构
1.镜筒
镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm),并且使该电子束在样品表面扫描,同时激发出各种信号。
2.电子信号的收集与处理系统
在样品室中,扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号,其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。在上述信号中,Z主要的是二次电子,它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子,产生于样品表面以下几nm至几十nm的区域,其产生率主要取决于样品的形貌和成分。通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像,它是研究样品表面形貌的Z有用的电子信号。检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体,当电子打到闪烁体上时,1就在其中产生光,这种光被光导管传送到光电倍增管,光信号即被转变成电流信号,再经前置放大及视频放大,电流信号转变成电压信号,Z后被送到显像管的栅极。
3.电子信号的显示与记录系统
扫描电镜的图象显示在阴极射线管(显像管)上,并由照相机拍照记录。显像管有两个,一个用来观察,分辨率较低,是长余辉的管子;另一个用来照相记录,分辨率较高,是短余辉的管子。
4.真空系统及电源系统
扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成,其作用是使镜筒内达到 10(4~10(5托))的真空度。电源系统供给各部件所需的特定的电源。
扫描电子显微镜样品制备
扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单,不需要包埋和切片。扫描电子显微镜样品的制备,必须满足以下要求:①保持完好的组织和细胞形态;③充分暴露要观察的部位;③良好的导电性和较高的二次电子产额;④保持充分干燥的状态。
某些含水量低且不易变形的生物材料,可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察,如动物毛发、昆虫、植物种 子、花粉等,但图象质量差,而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。对大多数的生物材料,则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥,然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
化学方法制备样品
化学方法制备样品的程序通常是:清洗;化学固定;干燥;喷镀金属。
1、清洗:某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌 、淋巴液及粘液等异物,掩盖着要观察的部位,因而,需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。
2、固定:通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与双固定,也可用单固定。固定不仅可良好地保存组织细胞结构,而且能增加材料的导电性和二次电子产额,提高扫描电子显微图象的质量。这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。为增强这种效果,可用-单宁酸或是-珠叉二胼等反复处理材料,使其结合更多的重金属锇,这就是导电染色。
3、干燥:固定后通常采用临界点干燥法。其原理是:适当选择温度和压力,使液体达到临界状态(液态和气相间界面消失),从而避免在干燥过程中由水的表面张力所造成的样品变形。对含水生物材料直接进行临界点干燥时,水的临界温度和压力不能过高(37.4℃,218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脱水,再用一种中间介质,如醋酸戊酯,置换脱水剂,然后在临界点干燥器中用液体或固体二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置换剂置换中间介质,进行临界干燥。
4、喷镀金属:将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上,然后放在真空蒸发器中喷镀一层50~300埃厚的金属膜,以提高样品的导电性和二次电子产额,改善图象质量,并且防止样品受热和辐射损伤。如果采用离子溅射镀膜机喷镀金属,可获得均匀的细颗粒薄金属镀层,提高扫描电子图象的质量。
冷冻方法制备样品
低温扫描电子显微术是20世纪80年代迅速发展和广泛应用的方法。它包括生物样品的冷冻固定、冷冻干燥、冷冻割断和冷冻含水样品的扫描电子显微术等。
1、冷冻固定:将生物材料投入低温的致冷剂中,如液氦、液氮、液体氟利昂及丙烷等。快速冷冻可使生物组织细胞的结构和化学组成接近于生活状态。被冷冻固定的生物样品,可以在低温条件下转移到具有低温样品台的扫描电子显微镜 中直接观察无需进一步处理或仅在冷冻样品表面喷镀一薄层金属。这种方法不仅快速简便,而且可以排除由于干燥法造成收缩的假象,特别适合于研究含水量很高的生物材料。
2、冷冻干燥:生物样品经冷冻固定后,其中的水分冻结成冰,表面张力消失;再将冷冻样品放于真空中,使冰渐渐升华为水蒸气。这样获得的干燥样品在一定程度上避免了表面张力造成的形态改变。
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