凝胶层析法分离蛋白质实验步骤

原理  

介绍层析的概念

所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：

a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体

b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。

c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体

d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。

e. 检测系统，用于检测试管中的物质。

由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。

要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力Z大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。

介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同

，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。

在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P)和琼脂糖凝胶(Agarose)。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖(又称右旋糖苷)在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。在合成时，调节葡聚糖和交联剂的比例，可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度，G值愈大，交联度愈小，网孔和吸水量越大。

本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。

材料

1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。

2．试剂 Sephadex  G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液  

方法

（一）凝胶的准备。由准备室制备。

（二）样品制备

1．血红蛋白(Hb)溶液的制备

取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。

3．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。

（三）装柱

取层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)一支，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡，然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约15cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。

（四）加样与洗脱：加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口。用滴管将样品(约0.4ml)小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水，待完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直至两条区带分开为止。

注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水