实验技术
(一)层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度,样品用量大,可加大柱的直径,一般制备用凝胶柱,直径大于2厘米,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外, 直径加大,洗脱液体体积增大,样品稀释度大。分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过1米。分族分离时用短柱,一般凝胶柱长20-30厘米,柱高与直径的比较5:1─10:1,凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1,常用凝胶柱有50×25厘米,10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支掌滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混合的可能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾出象,降低分辩力。在精确分离时,死体积不能超过总床体积的1/1000。
(二)凝胶的选择
根据所需凝胶体积,估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍,例如Sephadex G-20的吸水量为20,1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好,但阻力大,流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好, 脱盐用Sephadex G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。
(三)凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸,这样可大大中速膨胀,通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时, 自然膨胀需24小时至数天,而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间,而且还可消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
(四)样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大,含蛋白为超过4%,粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%(一般约0.5-2ml),进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%,在蛋白质溶液除盐时,样品可达凝胶床的20-30%。 分级分离样品体积要小,使样品层尽可能窄,洗脱出的峰形较好。
(五)防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中十分重要,常用的YJ剂有:
⑴叠氨钠(NaN3)在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易溶一水,在20℃时约为40%;它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因此叠氮钠不影响抗体活力;不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果Z佳,在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为YJ剂使用浓度为0.05-0. 01%。在微酸性溶液中Z为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合,因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的YJ效果。
⑷苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果Z佳,长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀;还原剂可引起此化合物分解;含疏基的物质亦可降低或YZ它的YJ作用。
主体内容:
一、 实验室要求:
凝胶色谱仪所使用流动相多为有毒的有机性试剂,实验室要保持良好的通风条件,试剂需专柜保存。实验室温度需保持在10℃~35℃,湿度小于80%。周围无腐蚀性气体,无尘土飞扬。
二、实验台要求:
实验台要求通水电良好,电源为220V±20 V,电源频率为50Hz±0.5 Hz,无剧烈震动。
三、仪器摆放要求:
仪器放在无阳光直射的地方,不要放在靠门、窗的地方,以减少空气、阳光对仪器带来的影响。
四、仪器操作规范:
样品经充分溶解后,再用过滤器过滤后才可使用;流动相也需现配后,再过滤使用;所有选用试剂均需选用色谱纯试剂。新色谱柱初次使用流速设置为0.2ml/min,冲洗1小时后再接检测器。仪器需专人经培训合格后才可使用,严格控制流速、压力。
注意:压力不得超过35Kg压力,否则色谱柱就会报废!
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